Las transferencias metabólicas entre múltiples simbiontes pueden beneficiar la profundidad

Oct 15, 2023

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 48 (2023) Citar este artículo

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Los mejillones batimodiolina dependen de simbiontes quimiosintéticos tiotróficos y/o metanotróficos para su nutrición, sin embargo, los simbiontes heterótrofos secundarios a menudo están presentes y desempeñan un papel desconocido en la aptitud del organismo. Los mejillones batimodiolinos Idas, que prosperan en filtraciones de gas y en madera hundida en el mar Mediterráneo y el océano Atlántico, albergan al menos seis linajes simbiontes que a menudo coexisten. Estos linajes incluyen los simbiontes primarios, gammaproteobacterias quimiosintéticas que oxidan metano y azufre, y los simbiontes secundarios, Mmethylophagaceae, Nitrincolaceae y Flavobacteriaceae, cuya fisiología y metabolismo son oscuros. Poco se sabe sobre si estos simbiontes interactúan o intercambian metabolitos y cómo lo hacen. Aquí seleccionamos genomas ensamblados en metagenomas de simbiontes de Idas modiolaeformis y utilizamos metatranscriptómica y metaproteómica centradas en el genoma para evaluar funciones clave de los simbiontes. El simbionte de Methylophagaceae es un autótrofo metilotrófico, ya que codifica y expresa la ribulosa monofosfato y las enzimas del ciclo de Calvin-Benson-Bassham, particularmente RuBisCO. El simbionte Nitrincolaceae ASP10-02a probablemente alimenta su metabolismo con macromoléculas ricas en nitrógeno y puede proporcionar al holobionte vitamina B12. Los simbiontes de Urechidicola (Flavobacteriaceae) probablemente degradan los glicanos y pueden eliminar el NO. Nuestros hallazgos indican que estas asociaciones flexibles permiten ampliar la gama de sustratos y nichos ambientales, a través de nuevas funciones metabólicas y transferencias.

Las simbiosis quimiosintéticas permiten a los animales y algunos protistas colonizar ambientes extremos, incluidos respiraderos hidrotermales y filtraciones frías en las profundidades del mar, así como hábitats productivos clave en áreas costeras, como las praderas de pastos marinos [1, 2]. La quimiosíntesis, es decir, la asimilación de moléculas de un solo carbono, como el dióxido de carbono y el metano, utilizando la energía almacenada en compuestos reducidos, principalmente azufre reducido (sulfuro, tiosulfato, azufre elemental) y metano, alimenta estas simbiosis. Las simbiosis quimiosintéticas suelen caracterizarse por una baja diversidad y alta fidelidad de simbiontes nutricionales clave a nivel de especie [3]. Exhiben una amplia gama de estrategias de transmisión, incluidos modos vertical, horizontal y mixto [4], que pueden determinar la fidelidad de estas asociaciones, así como la fuerza de la selección ambiental para los simbiontes más aptos y la diversidad genética dentro de las poblaciones de simbiontes [3 , 5,6,7]. Al igual que en las poblaciones bacterianas de vida libre, la diversidad genética amplía las funciones de los simbiontes, permitiendo que el holobionte adquiera nuevas capacidades metabólicas y nichos ambientales [8, 9].

La diversidad taxonómica y funcional de los simbiontes varía notablemente entre linajes de mejillones batimodiolina, que incluyen los géneros quimiosintéticos Bathymodiolus, Gigantidas e Idas, entre otros [10]. Los simbiontes clave de los mejillones batimodiolina incluyen las Thioglobaceae (orden gammaproteobacteriano PS1, también conocido como clado SUP05), que oxidan el azufre, y las bacterias oxidantes de metano Methyloprofundus (orden gammaproteobacteriano Methylococcales). Algunos mejillones batimodiolina, como Bathymodiolus earlougheri, B. billschneideri y B. nancyschneideri albergan poblaciones de una sola especie de simbiontes tiotróficos [11], mientras que Gigantidas childressi y G. platifrons albergan principalmente bacterias oxidantes de metano [12,13,14]. Otros albergan ambos [15]. También hay casos extremos de pérdida y ganancia de diversidad de simbiontes en simbiosis de batimodiolinas. Por ejemplo, un pequeño mejillón batimodiolina de aguas profundas, Idas argenteus, parece carecer de simbiontes, que pueden haber sido adquiridos en el pasado y recientemente perdidos [16]. Otros, como B. heckerae, del profundo Golfo de México, albergan varios taxones de simbiontes con funciones distintas: aparte de dos especies de simbiontes oxidantes de metano y dos especies de simbiontes oxidantes de azufre, B. heckerae tiene simbiontes bacterianos adicionales, incluyendo Methylophagaceae sp. metilotrofos, así como Cycloclasticus que catabolizan alcanos de cadena corta [17,18,19].

Aquí nos centramos en otro caso extremo de simbiosis de múltiples especies en mejillones batimodiolinos, a saber, los mejillones Idas del mar Mediterráneo. Varios estudios previos observaron la coexistencia de al menos seis filotipos simbiontes de branquias en una especie de Idas del Atlántico este y el Mar Mediterráneo; esta especie de Idas fue identificada por primera vez como Idas sp. MED, y ahora se llama Idas modiolaeformis [20,21,22,23]. Estos pequeños mejillones prosperan en filtraciones y caídas de madera y la diversidad de sus simbiontes parece estar relacionada con la disponibilidad y composición de fluidos reducidos [20]. Los primeros estudios identificaron los siguientes seis filotipos clave: los metanótrofos tipo I (M1) relacionados con Methyloprofundus sedimenti, dos filotipos de simbiontes oxidantes de azufre de Thioglobaceae (S1 y S2), los metilotrofos de Methylophagaceae (M2), así como dos filotipos que carecían del potencial por ser quimiosintético: Bacteroidetes (CFB) y un linaje gammaproteobacteriano (G) [21]. De aquí en adelante nos referiremos a los metanótrofos (M1) y tiotrofos (S1 y S2) como simbiontes primarios, y a los demás como simbiontes secundarios (M2, CFB y G). Se encontró que estos filotipos estaban asociados con bacteriocitos en el tejido branquial portador de simbiontes mediante hibridación fluorescente in situ (FISH), lo que confirma la naturaleza simbiótica de su asociación con I. modiolaeformis [21, 22]; sin embargo, estas observaciones no proporcionaron pruebas concluyentes de la localización intracelular de todos los simbiontes [22]. Más tarde se descubrieron otras variantes de los simbiontes secundarios gammaproteobacterianos [20, 23]. Si bien las funciones de los simbiontes primarios y del metilotrofo M2 se estimaron basándose en la detección de genes marcadores, la funcionalidad de los metilotrofos simbióticos no se ha estudiado en detalle mediante ómicas y se sabe poco sobre el papel de otros linajes de simbiontes.

Nuestro objetivo era caracterizar el metabolismo y la fisiología de los simbiontes Idas, utilizando metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica centradas en el genoma. Recolectamos 14 individuos de Idas de filtraciones de hidrocarburos y charcos de salmuera frente a la costa de Israel [24, 25]. Nuestra hipótesis es que los simbiontes secundarios pueden contribuir a la aptitud del holobionte al proporcionar funciones importantes a través de transferencias metabólicas. Alternativamente, estos potenciales heterótrofos, que son más abundantes en los mejillones que colonizan restos de plantas, como la madera hundida, pueden extraer nutrientes de sustratos orgánicos [20, 23]. Por lo tanto, investigamos el potencial metabólico de los simbiontes Idas, proporcionando una instantánea de las interacciones huésped-simbionte-simbionte en esta simbiosis específica de varios miembros.

Se encuentran filtraciones de hidrocarburos en la punta de la perturbación de Palmahim, una gran característica de deformación en el margen israelí [26, 27] (Figura complementaria S1). En 2011, recolectamos un espécimen de Idas de una muestra de carbonato que se recuperó de la marca de viruela de Palmahim 32°09.6′N y 34°10.0′E a una profundidad de 1036 m, utilizando un vehículo operado a distancia (ROV) Hercules, basado en el Nautilus. E/V. En 2021, se recolectaron varios individuos (n = 14 estudiados en este documento) de los bordes de un charco de salmuera en el pie de la perturbación Palmahim, a 1150 m de profundidad de agua (32° 13,4' N 34° 10,7' E) [25], utilizando el ROV SAAB Seaeye Leopard de clase laboral, basado en el R/V Bat Galim (Figura complementaria S1).

Conservamos un solo individuo recolectado en 2011, así como 5 individuos que fueron recolectados en 2021, a -20 °C. El ADN se extrajo de estos individuos utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se construyeron bibliotecas de ADN para estos seis individuos en HyLabs, Israel, y se secuenciaron utilizando 120 millones de lecturas de extremos emparejados de 2 × 150 pb por muestra con un Illumina NovaSeq en GENEWIZ, Alemania.

Se conservaron 4 individuos adicionales en RNAlater. Se extrajeron ADN, ARN y proteínas de estos individuos utilizando el mini kit AllPrep DNA/RNA/Protein (Cat. No. 80004, Qiagen). Se construyeron bibliotecas de ARN para estos individuos en Novogene, Singapur, y se secuenciaron utilizando 100 millones de lecturas de extremos pareados de 2 × 150 pb por muestra con un Illumina NovaSeq, luego de la construcción de la biblioteca con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra para Illumina (Cat No. 7530). ) y agotamiento del ARN ribosómico con el kit de agotamiento de ARNr Ribo-Zero Plus (bacterias) (n.º de catálogo 20037135) y el kit magnético Ribo-Zero (hoja de planta).

Resuspendimos los precipitados de proteínas de los 4 individuos extraídos con el kit AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit en 60 µl de tampón de lisis SDT [SDS al 4% (p/v), Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, DTT 0,1 M] y se calentó a 95 °C durante 10 min. La mezcla de proteínas SDT se limpió, redujo, alquiló y digirió utilizando el protocolo de preparación de muestras asistida por filtración (FASP) como se describió anteriormente [28]. Realizamos todos los pasos de centrifugación mencionados a continuación a 14.000 x g. Combinamos lisados ​​(60 μl) con 400 μl de solución de urea (urea 8 M en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5) y los cargamos en filtros centrífugos de 500 μl de 10 kDa MWCO (VWR International) seguido de centrifugación durante 20 min. Lavamos los filtros una vez aplicando 200 μl de solución de urea seguido de 20 minutos de centrifugación para eliminar cualquier SDS restante. Realizamos la alquilación de proteínas agregando 100 μl de solución de IAA (yodoacetamida 0,05 M en solución de urea) a cada filtro e incubando durante 20 minutos a temperatura ambiente seguido de centrifugación durante 20 minutos. Los filtros se lavaron tres veces con 100 µL de solución de urea con centrifugaciones de 15 min, seguido de un intercambio de tampón a ABC (bicarbonato de amonio 50 mM). El intercambio de tampón se logró mediante tres ciclos de adición de 100 µl de tampón ABC y centrifugación durante 15 minutos. Para la digestión tríptica, agregamos 1 μg de tripsina de grado MS (ThermoFisher Scientific) en 40 μl de tampón ABC a cada filtro y lo incubamos durante 16 h en una cámara húmeda a 37 °C. Eluimos los péptidos trípticos agregando 50 µl de NaCl 0,5 M y centrifugando durante 20 minutos. Las concentraciones de péptidos se determinaron con el ensayo Pierce Micro BCA (ThermoFisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Todas las muestras proteómicas se analizaron mediante 1D-LC-MS/MS como se describió anteriormente [28]. Cargamos 1,2 μg de péptido de cada muestra en una precolumna Acclaim® PepMap100 C18 de 5 mm y 300 μm de ID (Thermo Fisher Scientific) con un cromatógrafo de nanolíquidos RSLC UltiMateTM 3000 (Thermo Fisher Scientific) en disolvente de carga A (acetonitrilo al 2%, 0,05% de ácido trifluoroacético). La elución y separación de péptidos en la columna analítica (columna EASY-Spray de 75 cm × 75 µm empaquetada con PepMap RSLC C18, material de 2 µm, Thermo Fisher Scientific; calentada a 60 °C) se logró a un caudal de 300 ml min- 1 usando un gradiente de 140 min que va desde 95 % de tampón A (0,1 % de ácido fórmico) y 5 % de tampón B (0,1 % de ácido fórmico, 80 % de acetonitrilo) a 31 % de tampón B en 102 min, luego a 50 % de B en 18 min. , y finalmente a 99% B en 1 min y terminando con 99% B. La columna analítica se conectó a un espectrómetro de masas Orbitrap-cuadrupolo híbrido Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) a través de una fuente Easy-Spray. Los péptidos eluidos se ionizaron mediante ionización por electropulverización (ESI). El arrastre se redujo mediante un lavado (inyección de 20 µl de acetonitrilo, 99 % de eluyente B) entre muestras. Los espectros MS1 se adquirieron realizando un escaneo MS completo a una resolución de 60.000 en una ventana de 380 a 1600 m/z. Los espectros de MS2 se adquirieron mediante adquisición dependiente de datos, seleccionando para la fragmentación los 15 iones peptídicos más abundantes (Top15) de los espectros precursores de MS1. Se aplicó una energía de colisión normalizada de 25 en la célula HCD para generar los fragmentos peptídicos para los espectros MS2. Otras configuraciones de la adquisición dependiente de los datos incluyeron: un tiempo máximo de inyección de 100 ms, una exclusión dinámica de 25 s y la exclusión de la fragmentación de iones con estado de carga +1. Se adquirieron alrededor de 50.000 espectros MS/MS por muestra.

Construimos una base de datos de secuencias de proteínas para la identificación de proteínas utilizando las secuencias de proteínas predichas a partir de los genomas ensamblados en metagenomas obtenidos en este estudio. Para identificar péptidos del huésped, utilizamos las secuencias de proteínas anotadas del mejillón batimodiolina Bathymodiolus childressi obtenidas en un estudio anterior (PRIDE PXD008089-1) [29], ya que no había secuencias de proteínas Idas anotadas disponibles. Agregamos secuencias de contaminantes de laboratorio comunes agregando la base de datos de secuencias de proteínas cRAP (//www.thegpm.org/crap/). La base de datos final contenía 49.401 secuencias de proteínas y está incluida en la presentación de PRIDE (consulte la declaración de acceso a los datos) en formato fasta. Las búsquedas de los espectros MS/MS en esta base de datos se realizaron con el nodo Sequest HT en Proteome Discoverer 2.3.0.523 como se describió anteriormente [30]. La tasa de descubrimiento falso de péptidos (FDR) se calculó utilizando el nodo Percolator en Proteome Discoverer y solo se retuvieron los péptidos identificados con una FDR del 5 % para la identificación de proteínas. Las proteínas se infirieron a partir de identificaciones de péptidos utilizando el nodo Validador de proteína-FDR en Proteome Discoverer con un FDR objetivo del 5 %. Para estimar la abundancia de especies en función de la biomasa proteica utilizando los datos metaproteómicos, seguimos el enfoque descrito anteriormente [31] con el criterio de filtro adicional de requerir dos péptidos únicos de proteína para que una proteína se conserve para los cálculos de biomasa.

Los metagenomas se ensamblaron usando SPAdes V3.15 con –meta k = 21,33,66,99,127 parámetros [32], luego del recorte del adaptador y la corrección de errores con tadpole.sh, usando la suite BBtools luego de la preparación de lectura con la suite BBtools (Bushnell, B, sourceforge.net/projects/bbmap/). El mapeo posterior y la combinación de genomas ensamblados en metagenoma (MAG) se realizaron utilizando DAStool, Vamb, Maxbin 2.0 y Metabat2 [33,34,35,36] dentro del marco Atlas V2.9.1 [37], utilizando el umbral de identidad de nucleótidos de desreplicación del genoma. de 0,975. La calidad de MAG se verificó utilizando Checkm2 [38] y QUAST [39]. La taxonomía se asignó utilizando GTDB-tk V2.1 [40]. La anotación funcional se llevó a cabo utilizando Rapid Annotations utilizando el servidor RAST de Subsystems Technology [41], y las anotaciones clave se verificaron mediante BLASTing en la base de datos NCBI. Las lecturas de ARN se recortaron en calidad y se asignaron a los MAG utilizando BBmap (Bushnell, B, sourceforge.net/projects/bbmap/), y los recuentos de lectura se asignaron a las secuencias de codificación utilizando FeatureCounts [42]. Los recuentos se normalizaron como transcripciones por millón (TPM), por separado para cada MAG [43].

Los análisis filogenéticos se realizaron con IQ-TREE 2 [44] o MEGA11 [45], basándose en el mejor modelo determinado por ModelFinder, luego del alineamiento de secuencia con MAFFT [46]. Para filogenómica, utilizamos GTOtree [47] y Fasttree [48], implementados en GTOtree. Los genomas mitocondriales se ensamblaron con MitoZ [49], se rotaron con MARS [50] y se alinearon con MAFFT [46].

Se fijaron cuatro individuos adicionales en paraformaldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x durante un máximo de 12 h a 4 °C, se enjuagaron tres veces en PBS 1x y se almacenaron a 4 °C en PBS 0,5x/etanol al 50%. Se deshidrató todo el tejido de individuos de Idas, se incluyó en cera de Steedman y se cortó en secciones de 8 μm como se describió anteriormente [19]. Para identificar los simbiontes secundarios, utilizamos las sondas BhecM2-822, ImedaG-193 y CF319 marcadas con Cy3, dirigidas a los simbiontes Methylophagaceae, Nitrincolaceae y Flavobacteriaceae, respectivamente [22]. Se usó EUB338 marcado con Cy5 dirigido a la mayoría de las bacterias como control positivo [51] y la sonda NON338 marcada con Cy3 se usó como control para la autofluorescencia de fondo [52]. Las fotomicrografías se adquirieron con el microscopio de barrido láser confocal Nikon A1R, utilizando el objetivo Plan Apocromático VC 61,5x con inmersión en aceite. El brillo y contraste de las imágenes se ajustaron con Adobe Photoshop (Adobe Systems, Inc., EE.UU.).

Los mejillones se identificaron como Idas modiolaeformis, basándose en el análisis de las secuencias de la citocromo c oxidasa I (MT-CO1) mitocondrial de los seis metagenomas, utilizando el identificador del sistema de datos Barcode of Life. Estas secuencias eran entre un 98,4% y un 98,6% similares a las de I. modiolaeformis en la base de datos (por ejemplo, los individuos del Atlántico oriental, KT216487 en NCBI). Los mejores resultados, con una similitud del 98,7% al 98,9%, fueron las secuencias de individuos Idas recuperados del volcán de lodo Nile Deep Sea Fan a una profundidad de 1693 metros (FM212787). De ahora en adelante nos referiremos a nuestras muestras como I. modiolaeformis, ya que entre otras especies conocidas de Idas, el siguiente impacto más cercano fue Idas macdonaldi con una similitud MT-CO1 más baja del 95%. Sin embargo, dado que los individuos de Plamahim Disturbance y Nile Deep Sea Fan no son genéticamente idénticos, es posible que el intercambio genético entre estas poblaciones sea bajo. Observamos cierta variación de MT-CO1 y secuencias mitocondriales completas entre los individuos de Palmahim correspondientes a la aparición de diferentes haplotipos. La distancia genética puede aumentar con la distancia geográfica o el tiempo, ya que el individuo que recolectamos en 2011 de una filtración distinta ubicada a varios cientos de metros del sitio de la piscina de salmuera donde se obtuvieron otros individuos, fue el más divergido (Figura complementaria S2). Sin embargo, como veremos más adelante, los filotipos del huésped no estaban vinculados a la diversidad del simbionte, de acuerdo con hallazgos anteriores [20].

Generamos genomas ensamblados en metagenomas (MAG) para los seis filotipos simbiontes clave de I. modiolaeformis. Observamos que, además de estos seis linajes, la combinación metagenómica dio como resultado el descubrimiento de MAG para dos taxones adicionales: una alfaproteobacteria Rhizobiales y una especie de Bdellovibrionaceae. Dado que la naturaleza de la asociación entre estas especies y I. modiolaeformis no está clara, ya que no han sido descritas previamente mediante la secuencia de amplicones, de ahora en adelante nos centraremos únicamente en los seis linajes detectados previamente. Para estos, se ensamblaron y agruparon genomas de buena o alta calidad (Tabla 1).

En los estudios anteriores de secuenciación basados ​​en amplicones, los simbiontes, particularmente los secundarios, solo se clasificaron en niveles taxonómicos de clase y filo. Utilizamos nuestros MAG para obtener asignaciones taxonómicas mejoradas a través de la herramienta de inferencia Genome Taxonomy Database (GTDB) y validamos su ubicación taxonómica utilizando filogenias basadas en las colecciones de referencia de genomas estrechamente relacionados de GenBank. Confirmamos que los simbiontes oxidantes de metano pertenecían al clado Methyloprofundus, también conocido como grupo metilotrófico marino 1 o MMG1, y verificamos su ubicación utilizando una filogenia de la proteína PmoA, ya que los genomas de la mayoría de los simbiontes de Mmethyloprofundus faltan en las bases de datos (Figura complementaria S3). ). Los oxidantes de azufre pertenecían a dos clados distintos, Candidatus Thioglobus A y Candidatus Thiodubilierella (inferencia GTDB, en adelante Thioglobus y Thiodubilierella). El nombre del género Thiodubilierella ha sido sugerido para los simbiontes de B. septemdierum [53] y se integró en la taxonomía GTDB. Sin embargo, se ha propuesto Thiomultimodus como un nombre alternativo para los clados Thioglobus y Thiodubilierella, con dos subclados SUP05 A y B [54]. Mientras que Thioglobus (SUP05 clado A) suele estar representado por especies de vida libre y simbiontes de almejas, Thiodubilierella (SUP05 clado B) se ha descrito sólo en simbiosis de mejillones [54]. De ahora en adelante nos referiremos únicamente a la nomenclatura de Thioglobus y Thiodubilierella para los dos clados simbiontes tiotróficos. La coexistencia de estos clados en un individuo sólo se ha documentado en B. heckerae [17,18,19] e I. modiolaeformis [22].

Las nuevas asignaciones taxonómicas basadas en MAG mejoraron enormemente la clasificación de los simbiontes secundarios y nos permitieron hacer predicciones sobre su fisiología basadas en parientes previamente caracterizados. Los simbiontes metilotróficos fueron asignados al clado Methylophagaceae GCA-002733105. La ubicación filogenética basada en un árbol que utiliza genes de copia única indicó que este clado carece de un representante cultivado e incluye linajes que se encuentran comúnmente en filtraciones frías (por ejemplo, el genoma del linaje más estrechamente relacionado, Mmethylophaga GLR1851, se seleccionó a partir de una muestra en el Depósitos de hidratos de gas de Hikurangi Margin), así como los únicos otros simbiontes de Methylophagaceae que se encuentran en B. heckerae (Figura complementaria S4).

El filotipo G pertenecía a la familia Nitrincolaceae ASP10-02a (Tabla 1, Figura complementaria S5). Las nitrincoláceas rara vez se encuentran en simbiosis; sin embargo, los simbiontes Rs1 y Rs2 del gusano devorador de huesos Osedax pertenecen a la familia Nitrincolaceae (género sin nombre Rs1) [55,56,57]. Las nitrincoláceas son importantes degradadores de compuestos ricos en nitrógeno, como los aminoácidos [55, 58, 59], y el clado ASP10-02a es prominente en la columna de agua, y a menudo exhibe una gran abundancia y actividad durante la proliferación de algas [60, 61]. Los simbiontes Idas y Osedax pertenecen a clados distintos dentro de Nitrincolaceae, sus secuencias del gen 16 S rRNA son sólo ~90% similares y su identidad de nucleótidos promedio (ANI) es <70%. Dado que los huéspedes prosperan en diferentes sustratos y que los simbiontes ocupan diferentes tejidos, planteamos la hipótesis de que las funcionalidades de estos simbiontes pueden diferir.

El filotipo Bacteroidota (CFB) pertenecía al género Urechidicola (Flavobacteriaceae) (Tabla 1, Figura complementaria S6). El primer representante cultivado del género Urechidicola, U. process, se aisló del intestino de una espátula marina, Urechis unicinctus [62]. Al igual que otras Flavobacteriaceae, como la estrechamente relacionada Lutibacter, Urechidicola puede degradar múltiples compuestos orgánicos, incluidos el ADN y el almidón [62, 63]. El pariente más cercano del simbionte Urechidicola en Idas se encontró en una biopelícula que degrada los huesos y está representado por el acceso del ensamblaje GenBank GCA_016744415.1. La afiliación taxonómica sugiere que ambos simbiontes secundarios son probablemente copiotrofos que pueden catabolizar materia orgánica rica en proteínas y difícil de degradar, como polisacáridos, ácidos nucleicos y péptidos, en el medio marino.

Las abundancias de lectura metagenómica de los simbiontes primarios variaron entre los seis individuos Idas que fueron analizados con metagenómica (Fig. 1). Un solo individuo (Idas 16) carecía de los simbiontes metilotróficos y oxidantes de metano. En este individuo, el simbionte Nitrincolaceae fue el más abundante y se encontró Urechidola (la metatranscriptómica y la metaproteómica, desafortunadamente, no se realizaron para este individuo). Realizamos metatranscriptómica y metaproteómica en cuatro individuos, que eran distintos de los utilizados para la metagenómica. En estos cuatro individuos, las abundancias relativas de simbiontes fueron consistentes entre las mediciones metatranscriptómicas y metaproteómicas, lo que muestra que los oxidantes de azufre fueron más abundantes en la muestra 3 (5% y 2% de biomasa para Thioglobus y Thiodubilierella, respectivamente, Fig. 1B, C). Es importante señalar que las abundancias relativas obtenidas de la metagenómica no se pueden comparar directamente con las abundancias relativas obtenidas con la metaproteómica; Las abundancias derivadas de la metagenómica son un buen estimador del número de células, mientras que las abundancias derivadas de la metaproteómica son un buen estimador de la biomasa de especies en una población microbiana [31]. Las bacterias oxidantes de metano fueron las más abundantes en las cuatro muestras analizadas con metatranscriptómica (~70–80%) y metaproteómica (~89–98% de la biomasa estimada). Las biomasas de los otros simbiontes fueron mucho más bajas, en el rango de 1,6 a 7,2% para ambos tiótrofos, y solo se detectaron muy pocos péptidos para Urechidicola. De acuerdo con el estudio anterior [20], nuestros datos sugieren que las proporciones de simbiontes difieren entre individuos, probablemente en función de las condiciones ambientales locales experimentadas por los individuos. Los simbiontes de Methylophagaceae pueden requerir la presencia de oxidantes de metano para suministrar metanol a su sustrato. Las nitrincoláceas se encuentran constantemente entre las muestras con metaómica y son metabólicamente activas, ya que se expresaron sus genes y proteínas. Los simbiontes de Mmethylophagaceae, Nitrincolaceae y Urechidicola parecen coexistir con los simbiontes primarios en el tejido branquial donde estaban presentes los simbiontes primarios (Fig. 2), de acuerdo con datos previos [22]. Sin embargo, todavía no está claro si los simbiontes secundarios son extra o intracelulares.

A Lea las abundancias en metagenomas (Idas12-16 son muestras del sitio de la piscina de salmuera, Idas2011 se recolectó en 2011 de carbonatos en un sitio de filtración cercano). B Leer abundancias en metatranscriptomas. C Estimaciones de biomasa basadas en proteómica siguiendo a Kleiner et al. 2017. Se realizaron metatranscriptómica y metaproteómica en los mismos cuatro individuos (tr1-4 equivalen a pr1-4). Debido a la baja confianza en la detección, las proteínas de Urichidicola no se contaron en el panel C.

A Todas las bacterias simbióticas se detectan con la sonda EUB338 (roja), y se pueden observar grandes morfotipos metanótrofos. Los simbiontes de B Mmethylophagaceae (sonda BhecM2-822, amarilla) parecen agregarse a menudo a lo largo del tejido branquial. Se encontraron simbiontes de C Nitrincolaceae (sonda ImedaG-193, amarilla) esporádicamente en todo el tejido. D Flavobacteriales (Urechidicola) simbiontes en los tejidos branquiales (CF319, amarillo). Se utilizó tinción DAPI para visualizar todo el ADN. La barra de escala es de 20 µm.

Los oxidantes de metano son los simbiontes nutricionales clave de I. modiolaeformis, como lo sugiere su abundancia en los metatranscriptomas y metaproteomas. El complejo particulado de metano monooxigenasa PmoCAB se expresó mejor tanto en niveles de ARNm como de proteína (Figura complementaria S7, aquí y en adelante consulte la Tabla complementaria S1 para obtener la lista completa de genes y proteínas expresados). La metanol deshidrogenasa tipo XoxF que contiene lantánidos fue la predominante; También se encontró la enzima dependiente de calcio MxaFI, pero expresada en niveles más bajos. La asimilación de carbono y la conservación de energía a partir de la oxidación de formaldehído funcionan a través de la vía de ribulosa monofosfato (RuMP), utilizando sólo la derivación de Entner-Doudoroff (ED), pero no la variante Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) [64], como el gen pfk que codifica la fosfofructoquinasa dependiente de pirofosfato no se encontró en los genomas del simbionte Mmethyloprofundus de I. modiolaeformis (Figura complementaria S7). Esto es similar a los simbiontes de Bathymodiolus japonicus y en contraste con los de Bathymodiolus platifrons, que tienen las variantes ED y EMP [65]. El ciclo de la serina está incompleto, ya que faltaba la hidroxipiruvato reductasa; sin embargo, algunas proteínas centrales de esta vía, como la serina-glioxilato aminotransferasa y la malil-CoA liasa, se expresaron sustancialmente tanto en los niveles de ARN como de aminoácidos, lo que indica que la vía parcial de la serina es funcional (Figura complementaria S7) [15 ]. Todos los genes en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA, Krebs) se encontraron y expresaron, por lo tanto, la energía se puede conservar mediante la oxidación de compuestos derivados de la asimilación de metano, como el piruvato (Figura complementaria S7). La desintoxicación de formaldehído y la oxidación a CO2 a través de la ruta disimilatoria de la tetrahidrometanopterina es probablemente prominente, debido a la alta expresión de esta vía, en particular, la de la 5,6,7,8-tetrahidrometanopterina hidroliasa (gen fae, figura complementaria S7). ). Tanto la respiración con oxígeno como con nitrato es factible, dada la presencia de NarGHIJ y NirK respiratorios, sin embargo, el complejo respiratorio IV se expresó en niveles mucho más altos, lo que indica que el oxígeno es el aceptor de electrones clave para la conservación de energía (Figura complementaria S7).

El metabolismo del simbionte Methylophagaceae es un caso raro de autotrofia metilotrófica en simbiosis quimiosintéticas. Su coexistencia con los oxidantes de metano sugiere que podrían usar metanol, formaldehído y otros metabolitos producidos por los oxidantes de metano. Los oxidantes de metano excretan metabolitos como metanol, formaldehído, formiato, acetato y succinato [66,67,68], que pueden ser utilizados por organismos concurrentes, en particular, metilotrofos [69]. Las asociaciones entre oxidantes de metano y metilotrofos están muy extendidas en las comunidades de vida libre [69, 70], y nuestros resultados sugieren que esta asociación desempeña un papel en la simbiosis de Idas.

Los simbiontes de Mmethylophagaceae carecen de metano monooxigenasas, pero expresan altamente la metanol deshidrogenasa dependiente de pirroloquinolina quinona (PQQ), así como las enzimas clave de la vía RuMP para la asimilación de formaldehído (Fig. 3). A diferencia de los simbiontes primarios oxidantes de metano, los metilotrofos codificaron y expresaron las variantes EMP y ED dependientes de ATP de la vía RuMP, que tienen distintas demandas energéticas [64]. La oxidación del formiato también es más flexible en los metilotrofos, ya que identificamos la aparición y expresión no solo de la formiato deshidrogenasa FdhAB que contiene dos subunidades de tungsteno, sino también de la molibdoenzima deshidrogenasa-O respiratoria (FdoGHI) que cataliza la oxidación del formiato a carbono. dióxido, donando electrones al grupo de quinonas solubles en la membrana [71,72,73,74]. Esto sugiere que la oxidación del formiato por sí sola puede alimentar el metabolismo del simbionte Methylophagaceae. Además de tener su origen en la oxidación del metano, el formiato utilizado también podría proceder del metabolismo mitocondrial [75]. En términos de aceptores terminales de electrones (TEA) para metanol y oxidación de formiato, solo encontramos genes para el uso de oxígeno como TEA y ningún gen para otros TEA como el nitrato.

Tanto la variante Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) como la Entner-Doudoroff (ED) de la vía de ribulosa monofosfato (RuMP) son factibles. Esta bacteria puede fijar carbono inorgánico mediante el ciclo de Calvin-Benson-Bassham (CBB). El ciclo del ácido tricarboxílico está incompleto, ya que no se encontró la 2-oxoglutarato deshidrogenasa (OGDH). Los genes son los siguientes: metanol deshidrogenasa mxaF; 3-hexulosa-6-fosfato sintasa hps/rmpA; 3-hexulosa-6-fosfato isomerasa hpi/rmpB; tkt transcetolasa; ribosa-5-fosfato isomerasa rpiA; fosforibuloquinasa prk; ribulosa-fosfato 3-epimerasa rpe; transaldolasa talB; 6-fosfofructocinasa pfk dependiente de ATP; fructosa-1,6-bifosfato aldolasa/fosfatasa fbp: glucosa-6-fosfato isomerasa gpi; glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa zwf; 6-fosfogluconolactonasa pgl; fosfogluconato deshidratasa edd; 2-deshidro-3-desoxi-fosfogluconato/2-deshidro-3-desoxi-6-fosfogalactonato aldolasa eda; fosfoglucomutasa pgm; glucosa-1-fosfato adenililtransferasa glgC; fuctosa-bisfosfato aldolasa fba; triosafosfato isomerasa tpi; enzima activadora de formaldehído; metilentetrahidrometanopterina deshidrogenasa mtdB; meteniltetrahidrometanopterina ciclohidrolasa mch; complejo formiltransferasa/hidrolasa fhcABCD; metilenetetrahidrometanopterina deshidrogenasa mtdA dependiente de NAD(P); plegado bifuncional de metilentetrahidrofolato deshidrogenasa/meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa; formiato-tetrahidrofolato ligasa fhs; formiato deshidrogenasa fdhAB; formiato deshidrogenasa, fdnGHI inducible por nitrato; gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa gapdh; fosfoglicerato quinasa pgk; fosfoglucomutasa pgm; enolasa eno; fosfoenolpiruvato sintasa ppsA; fosfoenolpiruvato carboxiquinasa pepck; bomba de oxaloacetato descarboxilasa Na(+) oadABC; piruvato deshidrogenasa aceEF-lpdA; citrato sintasa gltA; aconitasa acnA; isocitrato deshidrogenasa idh; complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa OGDH; succinato-CoA ligasa sucCD; succinato deshidrogenasa sdhABC; fumarato hidratasa clase I, fumA aeróbica; malato:quinona oxidorreductasa mqo. Metabolitos: OA, oxaloacetato; PEP, fosfoenolpiruvato; 2-fosfoglicerato, 2PG; 3-fosfoglicerato, 3PG; 1,3-bisfosfoglicerato 1,3BPG; 3-fosfogliceraldehído, G3P; fosfato de dihidroxiacetona, DHAP; fructosa 1,6-bifosfato, F1,6BP; fructosa 6-fosfato, F6P; hexulosa 6-fosfato, H6P; ribulosa 5-fosfato, Ru5P; ribulosa-1,5-bifosfato, Ru1,5BP; ribosa 5-fosfato, R5P; glucosa 6-fosfato, G6P; 6-fosfogluconolactonasa, 6PGL; 6-fosfato de 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato, 6PGC; 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, KPDG; glucosa 1-fosfato, G1P; ADP-glucosa, ADP-G; tetrahidrofolato, H4F; tetrahidrometanopterina, H4MPT. Se muestran los valores de expresión promedio de 4 individuos.

Además de la vía RuMP, los simbiontes de Methylophagaceae tienen los genes para todos los pasos del ciclo de Calvin-Benson-Bassham (CBB) y expresan en gran medida la enzima clave, la forma II ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO, Fig. 3). . Observamos que aunque la forma I RuBisCo parecía estar muy extendida en Methylophagaceae, la forma II RuBisCo era rara en este clado (Figura complementaria S8). Estas formas de RuBisCo estrechamente relacionadas difieren en su afinidad por el oxígeno y el CO2, y las enzimas de la forma II tienen un factor de especificidad bajo, es decir, funcionan mejor en condiciones de alto CO2 y bajo O2 [76,77,78]. Estas condiciones pueden existir en los bacteriocitos del huésped, dando una ventaja a las bacterias con la forma II RuBisCO [79].

Al igual que en los autótrofos obligados [80, 81], el ciclo del TCA parece ser incompleto en la mayoría de las metilofagáceas cultivadas, que carecen de la actividad 2-oxoglutarato deshidrogenasa [82,83,84]. No encontramos los genes que codifican la 2-oxoglutarato deshidrogenasa en el MAG de alta calidad de las Methylophagaceae simbióticas, lo que indica que el ciclo del TCA estaba incompleto. El TCA incompleto permite la producción de compuestos intermedios a partir de compuestos de un carbono (C1) y evita ciclos inútiles, es decir, la destrucción de compuestos orgánicos más grandes mediante el catabolismo. Esto es típico de los metilotrofos obligados, como los flagelados de Methylobacillus [85]. En estas bacterias, la energía y los equivalentes reductores pueden resultar en gran medida de la oxidación del formaldehído a CO2 [85] (Fig. 3).

Los dos simbiontes oxidantes de azufre, las especies Thioglobus y Thiodubilierella, parecen ser autótrofos obligados, ya que las enzimas clave del ciclo del TCA, la 2-oxoglutarato deshidrogenasa y la malato deshidrogenasa, no se encontraron en ninguno de los MAG (Figura complementaria S9). Esto está de acuerdo con observaciones previas de organismos simbióticos y de vida libre de este clado [54, 86, 87]. Ambos simbiontes oxidantes de azufre tienen los genes para obtener energía de los compuestos de azufre utilizando el sulfuro: quinona oxidorreductasa (Sqr), el sistema de oxidación de azufre Sox (SoxYZXAB) y el sistema de reducción de sulfito disimilatorio inverso (rDSR), que cataliza la oxidación de sulfuro a sulfato a través del adenosina-5'-fosfosulfato, utilizando la adenililsulfato reductasa y la sulfato adenililtransferasa para los dos pasos finales de la vía. Los genes que codifican estas funciones se encontraban entre los transcritos con mayor abundancia en los metatranscriptomas y, a menudo, se detectaban a nivel de proteína (Figura complementaria S9). Ambos linajes expresaron altamente las enzimas del ciclo de Calvin-Benson-Bassham, en particular las dos subunidades del RuBisCo tipo I (en particular, los genes rbclLS y las proteínas respectivas). Estos autótrofos obligados probablemente puedan importar algunos compuestos orgánicos similares a los simbiontes de Bathymodiolus azoricus [15], ya que se codificaron y expresaron sistemas de transporte de dicarboxilato de tipo TRAP (dicarboxilato C4 y sustrato 6 desconocido en Thioglobus, solo este último en Thiodubilierella).

Se observaron varias diferencias entre Thioglobus y Thiodubilierella en el uso de su aceptor terminal de electrones. Sólo Thiodubilierella portaba el NapABGH periplásmico para el uso de nitrato como aceptor terminal de electrones, lo que confirma la modularidad del metabolismo del nitrógeno en el clado Thioglobaceae [54]. También encontramos algunas discrepancias en la respiración de oxígeno: Thioglobus codificaba y expresaba altamente solo los genes ccoNOP que codificaban la citocromo c oxidasa de tipo cbb3, mientras que Thiodubilierella codificaba tres variantes (cbb3, bo3, ba3). Estas oxidasas terminales difieren en su afinidad por el O2 y el H2S [88], lo que probablemente destaca la adaptación a distintas condiciones redox.

Los datos de los tres enfoques metaómicos sugirieron que el simbionte de Nitrincolaceae es un heterótrofo capaz de utilizar numerosos sustratos, dada la presencia y expresión sustancial del ciclo completo de TCA, así como el de múltiples sistemas de transporte de compuestos orgánicos, como péptidos, aminoácidos y nucleósidos, en línea con la reconstrucción metabólica de los simbiontes de Osedax Nitrincolaceae [55, 59]. Los ejemplos relevantes incluyen: (1) la mayoría de las enzimas para la degradación de aminoácidos de cadena ramificada coexistieron en los genomas y se transcribieron (Fig. 4); (2) un transportador de riboflavina/purina/nucleósido del grupo 11 RfuABCD, que se agrupa con enzimas de degradación de nucleósidos, como desaminasas y fosforilasas (Cda, Ada, DeoABC); (3) el sistema de transporte de putrescina (PotABCD) y degradación (PuuABCDE) (aunque no se encontró el gen puuC, probablemente debido a un problema de ensamblaje, ya que estos genes se produjeron en el borde de un contig). Un grupo de genes adicional codificaba la maquinaria completa PaaA-K y HpaA-I para el catabolismo del fenilacetato y el hidroxifenilacetato [89]. Esta vía permite la degradación de aromáticos orgánicos recalcitrantes derivados de plantas, especialmente en bacterias marinas que prosperan en condiciones fluctuantes de oxígeno en el Mar Mediterráneo [90, 91]. Algunas reacciones catabólicas pueden llevarse a cabo de forma anaeróbica, particularmente dado el potencial fermentativo de esta bacteria, sugerido por la presencia de lactato deshidrogenasas (algunas expresadas a nivel de ARNm, Fig. 4). También identificamos los genes para la respiración de nitrato a óxido nítrico, incluidos los genes para la nitrato reductasa respiratoria NarGHIJ y la nitrito reductasa dependiente de cobre NirK. El gen nirK estaba entre los genes más expresados ​​a nivel de ARNm en este simbionte (Fig. 4). Sin embargo, es probable que el oxígeno sea el aceptor de electrones clave para estos simbiontes, ya que los genes codificantes del complejo IV cbb3 y caa3 se expresaron altamente a nivel de ARNm (Fig. 4).

El ciclo del ácido tricarboxílico está completo. Es probable que el simbionte pueda fermentar piruvato a lactato, ya que se encontraron y expresaron las D-lactato y L-lactato deshidrogenasas dependientes del citocromo c. Se codifica y transcribe parcialmente una vía casi completa de adenosilcobalamina (B12). * Entre las proteínas presentadas, sólo la glutamina sintetasa (gen glt) se expresó a nivel de proteína. Los contornos del mismo color indican grupos de genes. Se muestran los siguientes genes: adenosina desaminasa ada, polirribonucleótido nucleotidiltransferasa pnp; citidina desaminasa cda; timidina fosforilasa deoA; fosfopentomutasa deoB; desoxirribosa-fosfato aldolasa deoC; aldehído-alcohol deshidrogenasa adhE; acetil-CoA carboxilasa accEF-lpdE; L-lactato deshidrogenasa ykgEFG; L-lactato deshidrogenasa ldh; citrato sintasa gltA; aconitasa acnA; isocitrato deshidrogenasa idh; complejo de 2-oxoglutarato deshidrogenasa sucAB-lpdE; succinato-CoA ligasa sucCD; succinato deshidrogenasa sdhABC; fumarato hidratasa clase I, fumA aeróbica; malato deshidrogenasa mdh; piruvato deshidrogenasa aceEF-lpdA; catabolón de fenilacetato paaA-K; catabolón hpaB-I de 4-hidroxifenilacetato; succinato-semialdehído deshidrogenasa [NADP(+)] gabD; catabolón de putrescina puuA-D; acetolactato sintasa ilvB; isovaleril-CoA deshidrogenasa ivd; acil-CoA deshidrogenasa acadsb específica de cadena corta/ramificada; enoil-CoA hidratasa ech; metilcrotonoil-CoA carboxilasa mcc1,2; metilglutaconil-CoA hidratasa auh; 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa hibch; hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa hadH; hidroximetilglutaril-CoA liasa hmgcl; 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa hibadh; acetil-CoA aciltransferasa hadhb; glutamina sintetasa glt; glutamato deshidrogenasa gdhA; glutamina amidotransferasa glxABC; ccoNOP de citocromo c oxidasa de tipo cbb3; citocromo c oxidasa de tipo caa3 ccaABC; nitrato reductasa respiratoria narGHIJ, nitrito reductasa que contiene cobre nirK; antiportador de nitrato/nitrito narK;. Los supuestos sustratos transportadores se mencionan en la figura. Gliceraldehído 3-fosfato, GAP; oxaloacetato, OA; 2-oxoglutarato, 2-OG. Se muestran los valores de expresión promedio de 4 individuos.

Una característica clave del metabolismo codificado en el genoma del simbionte Urechidicola (Flavobacteriaceae, Bacteroidota) es su potencial para degradar glicanos (polisacáridos). Los Bacteroidota, en particular las Flavobacteriaceae, son degradadores ubicuos de glicanos complejos y se encuentran en muchos entornos, desde el moco intestinal humano hasta la proliferación de algas en el océano [92,93,94,95]. La diversidad de glicanos es muy grande y la degradación de glicanos se lleva a cabo mediante una serie de enzimas activas en carbohidratos (CAZimas) que a menudo se organizan en loci de utilización de polisacáridos (PUL), que son típicos de Bacteroidota [92]. Las características clave de los PUL son la presencia de transportadores SusCD: la lipoproteína SusD de unión a glicanos de la superficie celular y el transportador SusC dependiente de TonB de la membrana externa, que se pueden encontrar en múltiples copias en los genomas de Bacteroidota [96, 97]. Identificamos cuatro pares de SusCD en el simbionte Urechidicola, dos de los cuales estaban entre los 50 genes más transcritos en los metatranscriptomas, y se detectó una proteína SusC en los metaproteomas a pesar de la baja tasa general de identificación de proteínas para este simbionte. Observamos que la cobertura de la secuencia de codificación genómica fue muy baja para Urechidicola en el metatranscriptoma (17%) y el metaproteoma (5%, en su mayoría con baja confianza) y, por lo tanto, estos análisis solo detectaron las características más activas. Dada la considerable fragmentación de este genoma (300 andamios), no pudimos identificar PUL grandes, sin embargo, se encontraron múltiples CAZimas y, a menudo, se agruparon (Fig. 5). Por ejemplo, un único contig de 30.996 pb contenía dos pares de SusCD, así como múltiples CAZimas, como la DD-carboxipeptidasa EC 3.4.16.4; L-Ala-D/L-Glu epimerasa EC 5.1.1.20; glucosamina-6-fosfato desaminasa EC 3.5.99.6; 6-fosfato eterasa del ácido N-acetilmurámico EC 4.2.1.126; así como un transportador MFS de muropéptidos de la familia AmpG; y glicosilhidrolasas de la familia 18, familia 10 y familia 3 (Fig. 5). Por lo tanto, los datos genómicos y transcriptómicos proporcionaron evidencia de la actividad degradante de glucanos de Urechidicola, aunque aún se desconoce si los sustratos se derivan de las branquias (p. ej., moco) o del medio ambiente. Hasta la fecha, los análisis FISH no muestran claramente si estas bacterias son endo o ectosimbiontes de las branquias de Idas. Una evidencia que sugiere que podrían ser ectosimbiontes es que la adhesión celular parece desempeñar un papel importante para Urechidola, ya que una secuencia que codifica la proteína del dominio FAS1 (fascilicina) se encontraba entre los 20 genes más transcritos [98, 99]. Una hipótesis que queda por explorar es si existen transferencias metabólicas entre los simbiontes de Urechidicola y Nitrincolaceae, por ejemplo, a través del intercambio de derivados aromáticos de la degradación de polímeros, como el fenilacetato y el hidroxifenilacetato [100].

A Filogenia y expresión a nivel de ARNm de las proteínas SusD (MEGA11, 576 posiciones de aminoácidos, modelo LG + G + I). Los valores de expresión se basan únicamente en una biblioteca de un único individuo Idas, en el que la expresión de estos raros simbiontes tenía una cobertura detectable. B El PUL contiguo más grande (~27.000 pb) en el simbionte Urechidicola comprendía dos pares susCD, así como genes que codificaban lo siguiente: regulador de la transcripción, deoR; cotransportador de sodio/yoduro, nis; ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa, murQ, glucosamina-6-fosfato desaminasa, nagB; Permeasa MFS, ampG; aminotransferasa, bioF; L-Ala-D/L-Glu epimerasa, ycgG; N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa, ampD; D-Ala-D-Ala carboxipeptidasa, dacA; Na+/antiportador de sustrato, nhaC; así como las glucósido hidrolasas 3,18,171,10. La mayoría de estos genes están implicados en el metabolismo de la mureína. * Indica que este gen fue identificado mediante una búsqueda de dominio NCBI, pero no mediante dbCAN. La lista completa de CAZymes está disponible en la Tabla complementaria S2. La escala de árbol representa el número de sustituciones por sitio. Se muestran los valores de expresión de un solo individuo (TR4, cobertura detectable de Urechidola).

El simbionte Nitrincolaceae puede producir adenosilcobalamina (vitamina B12), dada la presencia de casi todos los genes necesarios para su síntesis (Fig. 4), similar a los simbiontes Nintrincolaceae Osedax [55, 59]. El gen cobG fue el único gen, de 25 genes para la biosíntesis de vitamina B12, que no fue detectado, probablemente debido a que el MAG está incompleto. Muchos de los genes de biosíntesis de vitamina B12 fueron transcritos y detectados en los metatranscriptomas. También encontramos los genes para la biosíntesis de vitamina B12 en el simbionte oxidante de metano, que probablemente sea un productor clave de adenosilcobalamina en I. modiolaeformis, dada su biomasa dominante en la mayoría de los individuos (Fig. 1). En huéspedes que carecen de simbiontes oxidantes de metano, la producción de B12 por parte de los simbiontes alternativos de Nitrincolaceae puede ser crucial para el holobionte. Las nitrincoláceas, específicamente el linaje ASP10-02a al que pertenecen los simbiontes, son (i) especies dominantes en los océanos fríos de la Tierra, (ii) a menudo se asocian con la degradación de la proliferación de algas, (iii) parecen ser los productores de B12 más destacados en estos hábitats. y (iv) suministrar B12 específicamente a Methylophagaceae, lo que sugiere que las asociaciones ASP10-02a-metilótrofo/autótrofo basadas en B12 pueden ser ventajosas en algunas condiciones [61, 101]. La dinámica basada en B12 juega un papel clave en la columna de agua [102], pero también en las simbiosis del intestino humano [103] y de los insectos [104] y, por lo tanto, también puede ser crucial para las simbiosis quimiosintéticas. El receptor de membrana externa BtuB del transportador de vitamina B12 se encontró en los genomas de los simbiontes Methyloprofundus, Thioglobus, Urechidicola y Methylophagaceae. Mientras que los simbiontes que oxidan metano probablemente sean protótrofos de la cobalamina, pero aún pueden absorberla del medio ambiente, los otros simbiontes son auxótrofos y pueden depender de su absorción.

En las bacterias, la reacción clave que puede depender de la cobalamina es la síntesis de metionina, ya que la metionina sintasa requiere cobalamina; por tanto, la falta de esta vitamina puede dificultar la síntesis de ADN, la regeneración de metionina y provocar la acumulación de homocisteína [105]. Thiodubilierella parece carecer del gen btuB necesario para la importación de B12; sin embargo, a diferencia del simbionte Thioglobus, que codifica solo la metionina sintasa dependiente de cobalamina (MetH; EC 2.1.1.13), Thiodubilierella tiene tanto MetH como metionina sintasa independiente de cobalamina (MetE; 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa; EC 2.1 .1.14), y por lo tanto pueden no depender de la cobalamina para la producción del aminoácido esencial metionina y, por tanto, para el crecimiento [104]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que, de manera similar a las simbiosis de insectos [104], la interacción entre el requerimiento, la síntesis y la absorción de cobalamina puede contribuir a determinar la complejidad de la simbiosis de Idas. En nuestro conjunto de datos metagenómicos, las abundancias relativas de lectura de Nitrincolaceae y Thiodubilierella, pero no de los simbiontes de Nitrincolaceae y Thioglobus, parecen correlacionarse positivamente (R2 = 0,79 y R2 = 0,03, respectivamente, para la regresión lineal de datos transformados logarítmicos centrados). Aunque la correlación de datos de composición debe tratarse con precaución, nuestros resultados sugieren la interdependencia de estas dos poblaciones de simbiontes.

Urechidicola parece ser la única bacteria capaz de realizar una desnitrificación completa a N2. La reducción de nitratos y nitritos puede ser catalizada por las enzimas periplásmicas nitrato reductasa heterodimérica (NapAB, no se encontró expresión) y la nitrito reductasa del citocromo c552 NrfAB (ambas subunidades se expresaron a nivel de ARNm). Los genes norBC que codifican la reductasa respiratoria de óxido nítrico (NO) estaban altamente transcritos. Lo más importante es que el gen nosZ que codifica la óxido nitroso reductasa periplásmica dependiente de sec fue el undécimo gen más transcrito en esta bacteria. Tanto los simbiontes oxidantes de metano como los metilotróficos pueden oxidar el nitrito a óxido nítrico, pero carecen de los genes necesarios para completar los pasos restantes de la desnitrificación. La respiración de nitrato simbionte puede contribuir a la aptitud del holobionte, ya que impulsa la conservación de energía durante la hipoxia inducida por perturbaciones naturales o cuando las válvulas de la cáscara están cerradas y reduce la competencia entre el huésped y el simbionte por el oxígeno [15]. La eliminación del producto tóxico de la respiración de nitrito, NO, podría beneficiar a los simbiontes [106]. Mientras que el simbionte Urechidicola solo está presente en baja abundancia, la desnitrificación completa probablemente sea beneficiosa principalmente para su población, que puede aprovechar el exceso de NO producido por el huésped o los otros simbiontes. Especulamos que en algunos casos el simbionte Urechidicola también puede contribuir a la eliminación de NO a nivel de holobionte.

La simbiosis de I. modialiformis tiene un mayor número de especies de simbiontes que las asociaciones quimiosintéticas típicas en la mayoría de los demás huéspedes. La flexibilidad metabólica en estas simbiosis amplía la gama de sustratos catabolizados y probablemente permite la colonización no sólo de ambientes quimiosintéticos sino también de sustratos orgánicos, como la madera. Esta plasticidad nutricional puede haber jugado un papel en la adaptación y transición evolutiva de estos mejillones desde sustratos orgánicos hasta las profundidades del mar [107]. Sin embargo, la mayoría de los mejillones batimodiolinos grandes, como Gigantidas y la mayoría de Bathymodiolus, albergan sólo unas pocas especies de bacterias quimiosintéticas, lo que destaca la ventaja de una diversidad de simbiontes limitada. La ampliación de la diversidad de simbiontes y la gama de sustratos puede generar costos energéticos, lo que resulta en tasas de crecimiento más bajas o una producción reproductiva reducida [20]. Estos costos pueden reducirse ya que sólo el simbionte que puede utilizar el sustrato abundante localmente crece hasta alcanzar grandes abundancias. Por ejemplo, en filtraciones y charcos de salmuera, donde el sustrato clave es el metano, el simbionte metanotrófico domina en términos de biomasa. Nuestra hipótesis es que incluso en ausencia de cantidades relevantes de sustratos orgánicos externos, los simbiontes secundarios podrían proporcionar beneficios adicionales, que incluyen el reciclaje y el uso eficiente de recursos como NO, metanol y formiato, así como compartir bienes como la vitamina B12 (Fig. .6). Algunas de estas interacciones positivas tienen equivalentes en comunidades de vida libre, lo que sugiere que las interacciones simbióticas pueden haber evolucionado en función de las interacciones existentes.

Las rutas C1 (amarillo), nitrógeno (verde) y macromolécula (negro) están resaltadas por flechas. Para el nitrato, las rutas comprenden tanto la asimilatoria como la disimilatoria. Se incluye una mitocondria (mt). DIC es carbono inorgánico disuelto.

Las lecturas sin procesar de ADN y ARN, así como los genomas ensamblados en metagenomas simbiontes, se depositaron en el NCBI con el número de acceso del proyecto PRJNA930646. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE [108] con el identificador de conjunto de datos PXD040273 (acceso del revisor en https://www.ebi.ac.uk/pride/login con nombre de usuario: reviewer_pxd040273@ebi .ac.uk y Contraseña: 1Td7u0kv).

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Agradecemos a todas las personas que ayudaron durante las expediciones, incluido el personal técnico y científico a bordo, los capitanes y la tripulación del R/V Bat Galim y E/V Nautilus, y los equipos que operan los ROV “Hercules” y “Yona”. Esta investigación utilizó muestras y datos proporcionados por el Programa de Exploración E/V Nautilus—expedición NA019. Agradecemos a Sharon Tal de la Unidad del Servicio de Histología de la Universidad de Haifa y a Boris Shklyar de la unidad de Bioimagen de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Haifa. Agradecemos a la Dra. Heather Maughan por la edición y los comentarios sobre el manuscrito. Este estudio fue financiado por la Fundación Científica Israelí (ISF, subvención 913/19 a MR-B), la Fundación Binacional Científica Estados Unidos-Israel (BSF, subvención n.º 2019055 a MR-B y MK), el Ministerio de Energía de Israel ( subvención nº 221-17-002 a MR-B) y la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. (subvención IOS 2003107 a MK).

Departamento de Biología, Instituto Nacional de Oceanografía, Investigación Oceanográfica y Limnológica de Israel (IOLR), Haifa, 3108000, Israel

Tal Zvi-Kedem y Maxim Rubin-Blum

Estación de Investigación Marina Morris Kahn, Departamento de Biología Marina, Facultad de Ciencias Marinas Leon H. Charney, Universidad de Haifa, Haifa, 3498838, Israel

Tal Zvi-Kedem y Dan Tchernov

Departamento de Biología Vegetal y Microbiana, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Raleigh, NC, 27695, EE. UU.

Simina Vintila y Manuel Kleiner

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TZ-K, MR-B y DT concibieron este estudio. Microscopía realizada por TZ-K. MR-B realizó bioinformática. SV y MK realizaron proteómica. MR-B y TZ-K compilaron los datos. MR-B, DT y MK obtuvieron financiación. TZ-K, MR-B y MK escribieron el artículo con las contribuciones de todos los coautores.

Correspondencia a Maxim Rubin-Blum.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zvi-Kedem, T., Vintila, S., Kleiner, M. et al. Las transferencias metabólicas entre múltiples simbiontes pueden beneficiar a los mejillones batimodiolina de aguas profundas. COMUN ISME. 3, 48 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00254-4

Descargar cita

Recibido: 18 de abril de 2023

Revisado: 25 de abril de 2023

Aceptado: 11 de mayo de 2023

Publicado: 20 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00254-4

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