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Nature volumen 592, páginas 122–127 (2021)Cite este artículo

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Durante la evolución del SARS-CoV-2 en humanos, surgió una sustitución D614G en la glicoproteína de pico (S); El virus que contiene esta sustitución se ha convertido en la variante circulante predominante en la pandemia de COVID-191. Sin embargo, aún se desconoce si la creciente prevalencia de esta variante refleja una ventaja de aptitud física que mejora la replicación y/o transmisión en humanos o se debe simplemente a efectos fundadores. Aquí utilizamos variantes isogénicas del SARS-CoV-2 para demostrar que la variante que contiene S(D614G) tiene una unión mejorada a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del receptor de la superficie celular humana, una mayor replicación en el epitelio primario de las vías respiratorias bronquiales y nasales humanas. cultivos, así como en un modelo de ratón humano con activación de ACE2, y una replicación y transmisibilidad notablemente aumentadas en modelos de hámster y hurón de infección por SARS-CoV-2. Nuestros datos muestran que la sustitución de D614G en S da como resultado aumentos sutiles en la unión y la replicación in vitro, y proporciona una ventaja competitiva real in vivo, particularmente durante el cuello de botella de la transmisión. Por tanto, nuestros datos proporcionan una explicación del predominio global de la variante que contiene S(D614G) entre los virus SARS-CoV-2 que circulan actualmente.

A finales de 2019, se detectó SARS-CoV-2 en Wuhan (provincia de Hubei, China)2,3 y rápidamente desencadenó la pandemia de COVID-19; a diciembre de 2020 se habían confirmado 70 millones de casos y 1,5 millones de muertes atribuibles a esta enfermedad4. El SARS-CoV-2 causa una neumonía potencialmente mortal en grupos de personas vulnerables5. La entrada del SARS-CoV-2 en las células depende de la interacción de S y ACE23,6. S es una proteína de fusión homotrimérica de clase I que comprende dos subunidades (S1 y S2) que están separadas por un sitio de escisión de proteasa. S1 forma una cabeza globular y es esencial para la unión al receptor, y S2 media la fusión de la envoltura viral con las membranas de la célula huésped. Durante la entrada, el dominio de unión al receptor dentro de la subunidad S1 se une a ACE2, lo que genera cambios conformacionales en la subunidad S2 y facilita la internalización del virus7,8. S(D614G) es una variante de S que contiene una sustitución fuera del dominio de unión al receptor que se cree que causa un cambio conformacional en la proteína, lo que mejora la unión de ACE2 y aumenta la probabilidad de infección1,9.

A medida que la pandemia ha ido avanzando, la variante del SARS-CoV-2 que contiene S(D614G) (en adelante, SARS-CoV-2G614)) ha sustituido rápidamente a la variante parental (con D en la posición del aminoácido 614 de S; en adelante, SARS- CoV-2D614) en frecuencia para volverse globalmente dominante. Tal cambio en la frecuencia de los genotipos podría deberse a un efecto fundador tras la introducción en una población altamente interconectada; alternativamente, el SARS-CoV-2G614 puede tener una ventaja física sobre el SARS-CoV-2D614. Algunos estudios han sugerido que la sustitución de D614G en S puede conferir una ventaja de aptitud física al virus al mejorar la entrada celular8,9. Para abordar el papel de la sustitución de D614G en S en la diseminación y predominio de SARS-CoV-2G614 durante la pandemia de COVID-19, caracterizamos la unión de S a la ACE2 humana (hACE2) y la cinética de replicación in vitro, y evaluamos la dinámica de infección y transmisión en vivo utilizando tres modelos animales. Nuestros datos muestran que la sustitución D614G en S confiere una mayor unión al receptor hACE2 y una mayor replicación en cultivos epiteliales primarios de las vías respiratorias humanas. Además, la comparación de variantes isogénicas recombinantes del SARS-CoV-2 demuestra que la sustitución D614G en S proporciona una ventaja competitiva en un modelo de ratón con activación de hACE2 y aumenta notablemente la replicación y transmisión en modelos de infección por SARS-CoV-2 en hámsteres y hurones sirios. .

Para medir los efectos de la sustitución de D614G en S, primero cuantificamos la unión de los monómeros del dominio S1 a hACE2 mediante interferometría de biocapa. Tanto S1 como S1(D614G) se unen eficazmente a hACE2; sin embargo, S1 (D614G) mostró una afinidad aproximadamente dos veces mayor que la de S1 (Fig. 1a, Tabla complementaria 2). De manera similar, S (D614G) tenía una mayor afinidad por hACE2 que la de S cuando se usaron formas monoméricas de longitud completa (Datos ampliados, figura 1a, tabla complementaria 2). La sustitución de D614G en S también dio como resultado una unión mejorada de S1 a hACE2 expresada exógenamente en células de riñón de hámster bebé (en adelante, células BHK-hACE2) (Fig. 1b, Datos ampliados, Fig. 1b). La unión de S1 o S1 (D614G) marcado con polihistidina a células BHK-hACE2 mostró que se unía más S1 (D614G) a células BHK-hACE2 que S1, por citometría de flujo (Fig. 1b, Datos ampliados, Fig. 1b). Cuando utilizamos construcciones recombinantes homodiméricas que comprenden S1 unido a un extremo C de IgG, observamos un efecto más notable en el aumento de la unión de la proteína S1 (D614G) a la célula BHK-hACE2 (Fig. 1b, Datos ampliados, Fig. 1b).

a, Afinidad entre S1 y hACE2 determinada por interferometría de biocapa. La proteína ACE2 marcada con Fc se cargó en la superficie de biosensores de captura de Fc antihumanos. La asociación se realizó utilizando S1 (izquierda) o S1(D614G) (derecha), seguida de disociación. Los datos representan tres réplicas biológicas. b, La unión de S1 marcada con polihistidina o marcada con Fc a células BHK-hACE2 se muestra como picos de fluorescencia, detectados mediante citometría de flujo. c, Cinética de replicación de virus recombinantes en células Vero E6 a 37 °C (izquierda) y células epiteliales nasales humanas a 33 °C (derecha). El sobrenadante se recogió en los momentos indicados y se tituló mediante ensayo de placa. D614, SARS-CoV-2D614; G614, SARS-CoV-2G614. d, Cinética de replicación de virus recombinantes en células NBE humanas a 33 °C (izquierda), 37 °C (centro) y 39 °C (derecha). El sobrenadante se recogió diariamente y se tituló mediante el ensayo TCID50. En c, d, los datos son la media ± sd de tres réplicas biológicas (células Vero E6) o cuatro réplicas técnicas (células epiteliales nasales humanas y NBE humanas). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student no pareada, bilateral, sin ajustes para comparaciones múltiples. e, f, Ensayo de competencia de virus recombinantes en células epiteliales nasales humanas a 33 °C (e) y células NBE humanas a 33 °C (f, izquierda), 37 °C (f, medio) y 39 °C (f, bien). El inóculo (ino.) se preparó mezclando dos virus y se usó para la infección del epitelio nasal humano (proporciones de PFU 1:1 (e, izquierda), 1:10 (e, medio) y 10:1 (e, derecha). 8 réplicas técnicas cada una) y células NBE humanas (relación UFP 1:1, 4 réplicas técnicas cada una). El lavado apical y el sobrenadante se recogieron diariamente y el ARN extraído se utilizó para NGS. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de lecturas de secuencia que codifican S o S(D614G). En experimentos de competición en células epiteliales nasales humanas y células NBE humanas, cada cuadrado representa un punto de datos individual. Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal sobre la base de los recuentos de lecturas de secuenciación para S y S(D614G), y se calcularon los valores de P para el coeficiente del grupo (variante). NS, no significativo (P > 0,05).

Datos fuente

Para evaluar el efecto de S(D614G) en el contexto de la infección por virus, generamos un par isogénico de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 utilizando un sistema de genética inversa de SARS-CoV-210. El clon molecular basado en el aislado Wuhan-Hu-1 es representativo del SARS-CoV-2D614 (refs. 10,11). La secuencia del SARS-CoV-2G614 isogénico se diseñó con una transición de A a G en la posición 23.403 para codificar una glicina en la posición 614 de S. La identidad del SARS-CoV-2G614 recombinante resultante se confirmó mediante siguiente análisis genómico. secuenciación de generación (NGS) del stock de virus (pase 1) utilizado en experimentos posteriores. La cinética de replicación de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 en células Vero E6 difirió sólo marginalmente (Fig. 1c). Evaluamos la cinética de replicación en cultivos de células epiteliales nasales humanas primarias y epiteliales bronquiales humanas normales (NBE humanas) cultivadas en condiciones de interfaz aire-líquido que se asemejan al revestimiento epitelial pseudoestratificado del epitelio respiratorio humano. No observamos diferencias significativas en las células epiteliales nasales humanas primarias después de la infección por SARS-CoV-2D614 o SARS-CoV-2G614 a 33 °C (la temperatura del epitelio nasal) (Fig. 1c). Por el contrario, el SARS-CoV-2G614 mostró títulos elevados en células NBE humanas a 33 °C, 37 °C y 39 °C, que imitan las temperaturas del tracto respiratorio superior, del tracto respiratorio inferior y de la fiebre, respectivamente (Fig. 1d). . La cinética de infección de células NBE humanas con los aislados naturales SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (SARS-CoV-2D614) o SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/2020 (SARS-CoV-2G614) mostró una mayor ventaja sutil para el SARS-CoV-2G614 a 37 °C y 39 °C (datos ampliados, figura 1c). Para refinar este análisis, realizamos experimentos de competencia infectando cultivos de células epiteliales nasales humanas y NBE humanas con una mezcla de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 isogénicos en proporciones definidas. En ambos sistemas primarios de cultivo de células respiratorias humanas, la proporción de SARS-CoV-2G614 a SARS-CoV-2D614 cambió a favor de SARS-CoV-2G614 durante cinco u ocho días de infección (Fig. 1e, f, Datos ampliados Figuras 1d, e, 2a, b). En conjunto, estos resultados muestran que la sustitución de D614G en S se asocia con una mayor unión de hACE2 y una mayor replicación en modelos primarios de células epiteliales de las vías respiratorias humanas de la infección por SARS-CoV-2.

Los ratones no apoyan la replicación eficiente del SARS-CoV-2 a menos que estén diseñados genéticamente para expresar hACE212,13. Para evaluar la aptitud relativa del SARS-CoV-2G614 in vivo, generamos ratones knock-in que expresan ACE2 humano bajo los elementos reguladores endógenos del Ace2 de ratón (Datos ampliados, figura 3a). Inoculamos por vía intranasal a ocho ratones hembra heterocigotos con una mezcla igual de ambos virus (SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614) en un experimento de competencia, combinando 1 × 105 unidades formadoras de placas (UFP) de cada variante (Fig. 2a). Monitoreamos las cargas de ARN viral en hisopos orofaríngeos diariamente y en varios tejidos (en los días 2 y 4 después de la inoculación) mediante PCR en tiempo real. No observamos ninguna pérdida significativa de peso corporal en ratones knock-in hACE2 hasta el día 4 después de la inoculación (Datos ampliados, figura 3b). Nuestro análisis longitudinal de hisopos orofaríngeos reveló una replicación eficiente del virus en el tracto respiratorio superior de ratones knock-in hACE2 en comparación con ratones de tipo salvaje (Fig. 2b). En consecuencia, las muestras de tejido recolectadas en los días 2 y 4 después de la inoculación revelaron cargas virales altas en los cornetes nasales, los pulmones y los bulbos olfatorios, y niveles más bajos en el cerebro (Datos ampliados, figuras 3c, d). Los niveles de ARN viral fueron bajos o indetectables en el bazo, el intestino delgado, los riñones y las heces (datos no mostrados). No encontramos ninguna lesión patológica manifiesta en los pulmones en los días 2 y 4 después de la inoculación (Tabla complementaria 3, 4). La NGS de los hisopos orofaríngeos reveló una ventaja neta para el SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614 en la mayoría de los ratones y en la mayoría de los momentos (Fig. 2c, Datos ampliados, Fig. 3e, f). Encontramos una ventaja de replicación similar para el SARS-CoV-2G614 en los órganos (Fig. 2d). En conjunto, estos resultados demuestran una mayor replicación del SARS-CoV-2G614 en un modelo de ratón que expresa ACE2 humana auténtica.

a, Esquema experimental para la infección intranasal de ratones knock-in hACE2 con SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 recombinantes. Se tomaron muestras de hisopos orofaríngeos diariamente y se analizaron muestras de tejido en subgrupos de 4 ratones a los 2 y 4 días después de la infección en 2 experimentos independientes. b, PCR cuantitativa con análisis de transcripción inversa (RT-qPCR) de hisopos orofaríngeos de ratones knock-in (KI) de hACE2 inoculados y de tipo salvaje. c, d, Gráfico circular de las frecuencias medias del nucleótido A o G en la posición 23.403 (correspondiente a D (en azul) o G (en naranja) en la posición del aminoácido 614, respectivamente). K1 a K8 indican ratones individuales. Cada gráfico circular ilustra la proporción de A/G detectada en muestras individuales de hisopos orofaríngeos (c) y tejidos (d) en el momento indicado después de la infección. ND, no detectado.

Datos fuente

Los hámsteres son muy susceptibles a la infección por SARS-CoV-2 y desarrollan una enfermedad que se parece mucho al COVID-19 panrrespiratorio, de moderado a grave, en humanos14,15,16. Para examinar la cinética de replicación de las variantes del SARS-CoV-2 utilizando un modelo de hámster, inoculamos por vía intranasal a siete hámsteres con SARS-CoV-2D614 o SARS-CoV-2G614 (1 × 105,1 dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) por hámster, y 104,5 TCID50 por hámster, respectivamente, calculado a partir de la titulación retrospectiva del inóculo) y los monitorearon durante cuatro días consecutivos. No observamos diferencias marcadas en el peso corporal, los títulos de virus eliminados o las cargas virales en el tejido del tracto respiratorio entre los dos grupos en la fase aguda (Datos ampliados, figuras 4c-e). Para ambas variantes, las cargas genómicas más altas se encontraron en los cornetes nasales seguidos del tejido pulmonar (Datos ampliados, figura 4e). Estas observaciones sugieren que la sustitución de D614G en S no tiene un efecto fuerte en los resultados clínicos ni una ventaja de replicación detectable en las infecciones por SARS-CoV-2D614 frente a SARS-CoV-2G614 en el modelo de hámster.

Por lo tanto, establecimos un experimento de competencia in vivo para dilucidar mejor las posibles diferencias de replicación y/o transmisión entre las variantes. Inoculamos por vía intranasal a seis hámsteres sirios donantes con una mezcla 1:1 (según el título infeccioso de UFP) de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 en experimentos de transmisión directa "uno a uno". Posteriormente confirmamos la proporción de ARN de las dos variantes dentro del inóculo utilizando NGS y la cuantificación absoluta mediante PCR de gotitas digitales con sondas de ácido nucleico bloqueadas específicas de alelo (Fig. 3). A las 24 h después de la inoculación, cada hámster inoculado se alojó con un hámster sin tratamiento previo. La carga de ARN viral en los lavados nasales diarios, los cambios en el peso corporal y los signos clínicos coincidieron con los datos publicados previamente14,15,16 (Datos ampliados, figuras 4a, b). La NGS de la composición de la secuencia de ARN viral de los lavados nasales reveló un cambio prominente hacia el SARS-CoV-2G614 dentro de las 48 h posteriores a la inoculación (Fig. 3, Datos ampliados, Fig. 4f, g). La eficiencia de transmisión fue del 100 % y el análisis de la composición de la secuencia de ARN mostró que el SARS-CoV-2G614 representaba más del 90 % del ARN viral en los hámsteres de contacto (Fig. 3). En resumen, 24 h después de la inoculación, los hámsteres inoculados con una proporción igual de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 transmiten principalmente el SARS-CoV-2G614.

Se ilustra la transmisión de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 por hámsteres en una configuración de pares, uno por uno, con contacto directo de hámsteres donantes y de contacto en cohabitación. Se tomaron muestras de lavados nasales diariamente entre el día 2 y el día 8 después de la infección (dpi), y finalmente a los 12 días después de la infección, y luego se analizaron. Gráfico circular de la fracción de nucleótido A o G en la posición 23.403 (correspondiente a D o G en la posición del aminoácido 614, respectivamente), medida por NGS de amplicones. Las copias del genoma se calcularon a partir de RT-qPCR utilizando un estándar de ARN. El color naranja de la silueta del hámster se refiere a la detección de G (es decir, SARS-CoV-2G614) y el azul a la detección de A (es decir, SARS-CoV-2D614) en la mayoría de los momentos. Coloración gris, no se detecta infección.

Datos fuente

Investigamos más a fondo la ventaja competitiva de S(D614G) en hurones, que representan un buen modelo de transmisión del SARS-CoV-217 en el que el virus se replica principalmente en el tracto respiratorio superior (asemejándose a infecciones leves en humanos). Inoculamos por vía intranasal a seis hurones con una mezcla 1:1 (según el título infeccioso de UFP) de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 en experimentos de transmisión directa uno a uno. Para los seis hurones inoculados, se confirmó la infección por SARS-CoV-2: los cambios de peso corporal y las cargas de ARN viral en los lavados nasales (Fig. 4, Datos ampliados, Fig. 5a, b) coincidieron con los datos publicados anteriormente17,18. En cinco de los seis hurones inoculados, el SARS-CoV-2G614 se convirtió en la variante dominante (Fig. 4, Datos ampliados, Fig. 5c, d). Además, la transmisión del SARS-CoV-2 se produjo en cuatro de las seis parejas de hurones. En cada par con transmisión exitosa, el SARS-CoV-2G614 prevaleció sobre el SARS-CoV-2D614 (Fig. 4). Todos los datos de NGS de las muestras de hurón se volvieron a analizar mediante cuantificación absoluta utilizando sondas de ácido nucleico bloqueadas específicas de alelo y análisis de PCR de gotitas digitales. En particular, el hurón inoculado del par 1 (en el que el SARS-CoV-2D614 predominaba como población viral) no transmitió el virus al contacto, a pesar de una carga genómica viral máxima de más de 10 millones de copias por ml. Por el contrario, la falta de transmisión en el par 4 (en el que el SARS-CoV-2G614 se convirtió en la variante dominante) se relacionó con cargas virales máximas inferiores a 500.000 copias del genoma por ml (Fig. 4). En resumen, el experimento de competencia en hurones reveló que el SARS-CoV-2G614 infectaba y se replicaba preferentemente en cinco de seis hurones inoculados, y los eventos de transmisión exitosos ocurrieron solo con el SARS-CoV-2G614.

Esquema de la configuración experimental, en la que se utilizaron seis parejas de un hurón donante alojado junto con un hurón de contacto ingenuo. Se tomaron muestras de lavados nasales diariamente entre el día 2 y el día 8 después de la infección, y finalmente a los 12 días después de la infección, y luego se analizaron. Gráfico circular de la fracción de nucleótido A o G en la posición 23.403 (correspondiente a D o G en la posición 614 del aminoácido, respectivamente). Cada gráfico circular ilustra la proporción de A/G detectada en muestras de lavado nasal individuales a lo largo del tiempo. El color naranja de la silueta del hurón se refiere a la detección de G (es decir, SARS-CoV-2G614) en la mayoría de los momentos, y el azul indica la detección de A (es decir, SARS-CoV-2D614). Los números representan copias totales del genoma por ml. Gris, no hay infección o el número de genoma viral es demasiado bajo para determinar la relación A/G mediante NGS.

Datos fuente

Se ha propuesto que la evolución del SARS-CoV-2 en humanos es un proceso no determinista en el que la diversificación del virus resulta principalmente de una deriva genética aleatoria, lo que sugiere que no está actuando una fuerte presión selectiva sobre su adaptación en humanos19. Sin embargo, desde la aparición de la sustitución D614G en S a principios de 2020, la variante SARS-CoV-2G614 se ha vuelto prevalente a nivel mundial1. Anteriormente se habían propuesto tanto un efecto fundador como cambios estructurales en S como fuerzas impulsoras para establecer la prevalencia del SARS-CoV-2G614. Estudios estructurales previos y el uso de virus pseudotipados han sugerido que el SARS-CoV-2G614 puede conferir una mayor infectividad como resultado de una mayor conformación "abierta" del dominio de unión al receptor para la unión al receptor o una mayor estabilidad de S1,9. En contraste con estos estudios (que utilizaron S trimérico recombinante), utilizamos un enfoque reduccionista para eliminar las complicaciones debidas a conformaciones "abiertas" o "cerradas" del dominio de unión al receptor en S trimérico. Encontramos que S1(D614G) o monomérico Ambos S(D614G) tenían una mayor afinidad por hACE2, que puede ser otro mecanismo que subyace al aumento de la replicación y transmisión del SARS-CoV-2G614.

Recientemente se han informado estudios que utilizan SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 isogénicos para evaluar el fenotipo en el contexto de la infección por SARS-CoV-220,21. Ambos estudios han demostrado que el SARS-CoV-2G614 aumentó la replicación in vitro, y uno21 observó una transmisión más temprana en un modelo de hámster. Ampliamos estos estudios explotando una variedad de modelos in vitro e in vivo de infección por SARS-CoV-2: cultivos primarios de células epiteliales nasales humanas y NBE humanas, un modelo de ratón activado para hACE2, un modelo de hámster y un modelo de hurón. A lo largo de estos sistemas experimentales, observamos constantemente una mayor aptitud replicativa del SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614, mediante la aplicación de técnicas NGS y cuantificación absoluta específica de alelo para la confirmación. La ventaja proporcionada por la sustitución de D614G en S fue más destacada en experimentos de competencia y transmisión en hámsteres y hurones y, por lo tanto, debe considerarse como una fuerza impulsora que ha llevado al dominio global del SARS-CoV-2G614.

Nuestros datos también concuerdan con los cambios funcionales previamente informados conferidos por la sustitución D614G en S1, y con el aumento de la infectividad previamente informado de virus pseudotipados que contienen esta sustitución9,22. Aunque nuestros estudios establecen un fenotipo de mayor replicación y transmisión del SARS-CoV-2G614, no hay evidencia de un cambio en la patogenicidad en ninguno de los modelos animales que utilizamos. Esto es importante porque la infección por SARS-CoV-2G614 no está asociada con el desarrollo de COVID-19 grave en humanos1.

La pandemia en curso probablemente dará lugar a variantes adicionales del SARS-CoV-2 que pueden mostrar cambios fenotípicos y mayores adaptaciones a reservorios humanos o animales (como los visones). La capacidad de identificar rápidamente variantes emergentes mediante la genómica, reconstruir variantes de virus emergentes y evaluar sus fenotipos in vitro e in vivo permitirá una respuesta rápida a su aparición con contramedidas adecuadas. El modelo de ratón descrito en este artículo, que se basa en la expresión de hACE2 bajo los elementos reguladores endógenos del Ace2 de ratón, es una herramienta valiosa y complementará los modelos animales existentes de infección por SARS-CoV-2. De manera similar a nuestra demostración aquí del aumento de la replicación y transmisibilidad del SARS-CoV-2G614, la evaluación fenotípica de futuras variantes probablemente requerirá varios modelos animales complementarios que en conjunto reflejen aspectos de la replicación, transmisión y patogenicidad del SARS-CoV-2 en humanos.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos ni a la evaluación de resultados, excepto cuando se indicara.

Las células Vero E6 (un regalo de M, Müller) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 1 × aminoácidos no esenciales, 100 unidades ml-1 de penicilina y 100 μg ml-1 de estreptomicina. . Las células de riñón de hámster bebé (BHK) que expresan la nucleoproteína (N) del SARS-CoV23,24 se mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 5%, 1 × aminoácidos no esenciales, 100 unidades ml. 1 penicilina y 100 μg ml-1 de estreptomicina, 500 μg ml-1 G418 y 10 μg ml-1 de puromicina. Veinticuatro horas antes de la electroporación, las células BHK que expresaban el SARS-CoV N se trataron con 1 μg ml-1 de doxiciclina para expresar la proteína N del SARS-CoV. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C y en una atmósfera de 5% de CO2.

Se utilizó el sistema de expresión Expi293 (ThermoFisher Scientific) para producir hACE2 y S. Se construyeron plásmidos de expresión de mamíferos para codificar hACE2 (hACE2-Fc) etiquetado con Fc (IgG1 humana) optimizado con codones o S (S y S (D614G) etiquetado con polihistidina. )), que contienen el ectodominio completo de S (residuos 1-1208, con un sitio de escisión de furina mutado y sustituciones K986P/V987P). Se transfectaron células Expi293F con los plásmidos y se cultivaron a 37 °C con 8% de CO2 a una velocidad de agitación de 125 rpm. El sobrenadante se recogió el día 5 mediante centrifugación a 3000 g durante 20 min a 4 °C. La proteína hACE2-Fc se purificó utilizando una columna HiTrap Protein A (GE Life Sciences) en un tampón de elución que contenía ácido cítrico 0,1 M, pH 3,0. S se purificó usando una columna HisTrap FF (GE Life Sciences) en un tampón de elución que contenía fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M e imidazol 500 mM, pH 7,4. Los eluyentes se desalinizaron utilizando una columna de desalación por rotación Zeba 7K MWCO (Thermo Fisher Scientific). Las proteínas purificadas se concentraron aún más en filtros centrífugos Amicon Ultra 50K NMWL (Sigma-Aldrich) y se cuantificaron utilizando el ensayo de proteínas Qubit (ThermoFisher Scientific).

La afinidad entre hACE2 – Fc y S1 (ABclonal, RP01262), S1 (D614G) (ABclonal, RP01287), S o S (D614G) se evaluó utilizando el instrumento Octet RED96 (ForteBio) a 30 ° C con una velocidad de agitación de 1000 rpm. Después de 20 minutos de prehidratación de biosensores de captura de Fc antihumano y 1 minuto de verificación del sensor, se cargó hACE2-Fc 7,5 nM en tampón cinético 10 × (ForteBio) sobre la superficie de los biosensores durante 5 minutos. Después de 1,5 minutos de equilibrio inicial, se realizaron 5 minutos de asociación con 25 a 200 nM de S1 o S1 (D614G), o con 10 a 100 nM de S o S (D614G), seguidos de 5 minutos de disociación en el mismo tampón. utilizado para el equilibrio inicial. Los datos se corrigieron restando la muestra de referencia; Se utilizó un modelo de unión 1:1 con ajuste global para la determinación de las constantes de afinidad.

Se sedimentó y resuspendió un clon estable de células BHK-hACE2 en tampón de reacción (PBS pH 7,4 con Tween-20 al 0,02% y BSA al 4%) a una concentración de 5 x 106 células por ml. Se dividieron en alícuotas de cien microlitros por pocillo de las células en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron en hielo durante al menos 5 minutos. Las proteínas S1 (40591-V08H) y S1 (D614G) (40591-V08H3) marcadas con polihistidina y S1 (40591-v02H) y S1 (D614G) (40591-v02H3) marcadas con Fc se adquirieron de Sino Biological y se diluyeron en la reacción. tampón sobre hielo. Se agregaron cincuenta microlitros de diluyentes S1 a los pocillos de células correspondientes y se incubaron en hielo durante 20 minutos con agitación. Después de la incubación, las células se lavaron una vez con 200 µl de solución de lavado de PBST (PBS pH 7,4 con Tween-20 al 0,02%) y luego con 100 µl de anticuerpo secundario diluido 1:300 (número de catálogo de ThermoFisher A-21091 para la etiqueta Fc). y ThermoFisher nº de catálogo MA1-21315-647 para la etiqueta de polihistidina) se añadió a cada pocillo de células, se mezcló y se incubó en hielo con agitación durante 15 minutos. Después de lavar dos veces, las células se resuspendieron en 200 µl de PBST y se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Los datos se procesaron utilizando Flowjo v.10.6.1. Los resultados de las células de control BHK (que no expresan hACE2) y la estrategia de activación se proporcionan en las figuras complementarias. 1, 2.

Para introducir la mutación para la sustitución D614G en el gen S, se realizó mutagénesis por PCR (Tabla complementaria 1) en el plásmido pUC57 que contiene el fragmento 1010 del SARS-CoV-2 utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England BioLab). Tanto los clones de ADNc infecciosos S como SD614G se generaron utilizando el método de clonación por recombinación asociada a transformación en levadura como se describió anteriormente10. La transcripción in vitro se realizó para el gen YAC escindido por EagI y el gen SARS-CoV-2 N amplificado por PCR utilizando el sistema de producción de ARN a gran escala T7 RiboMAX (Promega) como se describió anteriormente4. El ARNm transcrito y protegido se sometió a electroporación en células de riñón de hámster bebé (células BHK-21) que expresaban la proteína N del SARS-CoV. Las células electroporadas se cocultivaron con células Vero E6 susceptibles para producir el pase 0 de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 recombinantes. Posteriormente, se utilizaron virus de progenie para infectar células Vero E6 frescas para generar reservas del paso 1 para experimentos posteriores.

La caracterización de la cinética de crecimiento del virus en Vero E6 se realizó como se describió anteriormente10. Veinticuatro horas antes de la infección, se sembraron células en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2,0 x 105 células por ml. Después de lavar una vez con PBS, las células se inocularon con virus con una multiplicidad de infección de 0,01. Después de 1 h, se eliminó el inóculo y las células se lavaron tres veces con PBS seguido de suministro con medio de cultivo apropiado.

Las UFP por ml de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 recombinantes se determinaron mediante un ensayo de placa en un formato de 24 pocillos. Un día antes de la infección, se sembraron células Vero E6 a una densidad de 2,0 x 105 células por ml. Después de lavar una vez con PBS, las células se inocularon con virus diluidos en serie en medio de cultivo celular a una dilución 1:10. Después de 1 h de incubación, se eliminó el inóculo y las células se lavaron con PBS y posteriormente se cubrieron con una mezcla 1:1 de Avicel al 2,4% y DMEM 2x suplementado con suero bovino fetal al 20%, 200 unidades ml-1 de penicilina y 200 μg ml-1. −1 estreptomicina. Después de 2 días de incubación a 37 °C, las células se fijaron en formalina tamponada neutra al 4% (v/v) antes de teñirlas con cristal violeta.

La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student bilateral no pareada sin ajuste para comparaciones múltiples.

Se adquirieron y manipularon cultivos primarios de células epiteliales nasales humanas (MucilAir EP02, Epithelix Sàrl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se adquirieron células NBE humanas (de la Universidad de Emory) y se cultivaron según los protocolos recomendados. Los cultivos epiteliales nasales humanos se inocularon con 0,5 × 105 UFP por pocillo, o mezclas de 1:1, 10:1 y 1:10 de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614. Se inocularon cultivos de células NBE humanas con 1,0 × 105 UFP por pocillo, o con los aislados de tipo salvaje SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (SARS-CoV-2D614) o SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/ 2020 (SARS-CoV-2G614), a 2 × 105 TCID50 por pocillo. Para los experimentos de competencia, se inocularon células NBE humanas con una mezcla de 1:1 o 9:1 de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 a 1 × 105 PFU por pocillo. Después de la incubación a 33 °C durante 1 o 2 h, para cultivos de células epiteliales nasales humanas o NBE humanas, respectivamente, se eliminó el inóculo (o se recogió para NBE humana como muestras de 2 h), las células se lavaron y posteriormente se incubaron (como se indica). ) a 33 °C, 37 °C o 39 °C. Para controlar la replicación viral, se recogieron lavados apicales cada 24 h. Todos los títulos se determinaron mediante ensayo de placa estándar o TCID50 en células Vero E6.

Para los experimentos de competición, se extrajo el ARN viral de los lavados apicales utilizando el kit QIAamp 96 Virus QIAcube HT (QIAGEN). El genoma del SARS-CoV-2 se amplificó mediante una reacción de PCR en mosaico altamente multiplexada basada en el protocolo Artic Network (https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-bbmuik6w) con algunas modificaciones. En resumen, los cebadores se diseñaron para producir amplicones superpuestos de 1 kb (Tabla complementaria 1). La transcriptasa inversa se realizó como se describe en el protocolo de Artic Network. La única reacción de ADNc se llevó a cabo mediante la preparación de dos reacciones de PCR (una para el conjunto de cebadores pares e impares). Se prepararon dos grupos de cebadores (pares e impares) para contener 0,1 µM de cada cebador individual. La PCR en mosaico del ADNc resultante se realizó combinando 12,5 µl de polimerasa 2X Q5, 5,5 µl de agua, 2 µl del conjunto de cebadores y 5 µl de ADNc, seguido de la incubación de la reacción a 98 °C durante 30 s, 38 ciclos de 98 °. C durante 15 s y 63 °C durante 5 min, y manteniendo a 4 °C. Los amplicones pares e impares correspondientes se normalizaron y agruparon para la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas fragmentadas se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT y se secuenciaron utilizando Illumina MiSeq. Los análisis se realizaron utilizando IRMA25 con un módulo SARS-CoV-2.

La preparación de ARN viral para NGS se realizó como se describió anteriormente10. En resumen, las células Vero E6 se infectaron con virus del paso 1. La extracción del ARN celular total se realizó utilizando el kit Nucleospin RNA Plus (Macherey-Nagel) según las instrucciones del fabricante.

Se preparó ARN de lavados apicales de células epiteliales nasales humanas y hisopos orofaríngeos de ratón utilizando el mini kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN) y el kit Nucleospin RNA (Macherey-Nagel) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

Para determinar las proporciones de SARS-CoV-2D614 a SARS-CoV-2G614 en ensayos de competencia en cultivos de células epiteliales nasales humanas y ratones knock-in hACE2, se realizó una PCR con transcripción inversa en ARN extraído utilizando RT-PCR de un solo paso SuperScript IV. Sistema (Invitrogen). Los cebadores específicos de secuencia se utilizaron para generar un amplicón de 905 pb que cubre la región D614: 5′-AATCTATCAGCCGGTAGCAC-3' y 5′-CAACAGCTATTCCAGTTAAAGCAC-3'. La reacción de RT-PCR se realizó en una reacción de 50 μl utilizando de 0,01 pg a 1 μg de ARN total. Los parámetros de ciclado se establecieron de la siguiente manera: 50 °C durante 10 min, 98 °C durante 2 min; 35 ciclos a 98 °C por 10 s, 55 °C por 15 s y 72 °C por 30 s; y una incubación de 5 minutos a 72 °C. La concentración de ADN se determinó utilizando el ensayo Qubit dsDNA HS (alta sensibilidad) (Thermo Fisher) y posteriormente se diluyó a 200 ng en 50 μl de agua libre de nucleasas para la secuenciación mediante MinION de secuenciación Nanopore.

La extracción de ARN y la preparación de reacciones de RT-PCR se realizaron en un entorno de laboratorio con pocas copias o sin copias para evitar la contaminación.

NGS secuenció los ARN recombinantes de SARS-CoV-2D614 o SARS-CoV-2G614 del stock de paso 1 como se describió anteriormente10. En resumen, se extrajo ARN de células Vero E6 infectadas con SARS-CoV-2D614 recombinante o SARS-CoV-2G614 utilizando el kit NucleoSpin RNA Plus (Macherey-Nagel) de acuerdo con las pautas del fabricante. Posteriormente, se prepararon bibliotecas de secuenciación utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARNm trenzado Illumina TruSeq (Illumina, 20020595) y se secuenciaron bibliotecas de ADNc agrupadas en dos carriles en una celda de flujo NovaSeq 6000 S1 (2 × 50 pb, 100 ciclos) utilizando la plataforma Illumina NovaSeq 6000. (Plataforma de secuenciación de próxima generación de la Universidad de Berna). Para el análisis de datos, se utilizó TrimGalore v.0.6.5 para eliminar lecturas y adaptadores de baja calidad de los archivos de secuenciación sin procesar. Las lecturas de extremos emparejados recortadas resultantes se alinearon con el genoma del SARS-CoV-2 (acceso a GenBank MT108784) utilizando Bowtie2 v.2.3.5. Finalmente, se generó una secuencia de consenso para cada stock de virus utilizando Samtools v.1.10 con la opción -d establecida en 10.000. El análisis de los datos se realizó en UBELIX, el clúster informático de alto rendimiento de la Universidad de Berna (http://www.id.unibe.ch/hpc).

Para experimentos de competencia de virus en células epiteliales nasales humanas, ratones knock-in hACE2, hámsteres y hurones, se secuenciaron amplicones en el sistema MinION de Oxford Nanopore. La llamada base de alta precisión, la demultiplexación y el recorte de códigos de barras y adaptadores en tiempo real se realizaron con MinKnow v.20.06.17, ejecutando Guppy v.s4.0.11. El análisis posterior se realizó en Geneious 2019 v.s2.3. La longitud de lectura se filtró para eliminar lecturas <800 y >1100 nt y las lecturas restantes se asignaron en subconjuntos de 10 000 lecturas a la referencia del amplicón sometidas a 2 iteraciones, con una sensibilidad personalizada que permite un máximo de 5 % de espacios y una discrepancia máxima del 30 %. Las variantes se analizaron en posiciones específicas calculando los valores de P para cada variante. La relación fracción A/G se calculó a partir del número de lecturas, como fracción = A lecturas/(A lecturas + G lecturas).

Los análisis estadísticos para experimentos de competencia de virus y cálculos de aptitud replicativa relativa se realizaron utilizando el paquete catseyes en R. Los valores de aptitud replicativa relativa para SARS-CoV-2G614 sobre SARS-CoV-2D614 se determinaron dividiendo el SARS-CoV-2G614/SARS- Relación CoV-2D614 (i0) por la relación final (después de la infección) SARS-CoV-2G614/SARS-CoV-2D614 (f0) según la fórmula w = (f0/i0). Específicamente, para modelar f0/i0 en cada experimento, la relación t1/t0 se calculó en base a los recuentos de secuenciación obtenidos para cada virus en muestras individuales (después de la infección, punto temporal t1) y en el inóculo (punto temporal inicial t0). . Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal en R y los índices de aptitud entre los dos grupos (variantes) se evaluaron mediante el coeficiente del término de grupo del modelo. Cuando se realizaron múltiples experimentos, la variable del experimento se incluyó en el modelo. Todas las pruebas estadísticas se realizaron en R (v.4.0.2) con α bilateral = 0,05. Los gráficos de ojo de gato que muestran la aptitud replicativa relativa del SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614 para cada punto temporal en cada experimento se crearon utilizando el paquete catseyes en R26, como se describió anteriormente20.

Los ratones knock-in hACE2 se generaron originalmente en el Centro Wadsworth, Departamento de Salud del Estado de Nueva York (protocolo IACUC nº 09-405) (investigador principal DEW). Los experimentos con ratones se llevaron a cabo de conformidad con la legislación suiza sobre bienestar animal y los estudios con animales fueron revisados y aprobados por la comisión para experimentos con animales del cantón de Berna bajo la licencia BE-43/20. Todos los experimentos con hurones y hámsteres fueron evaluados por el comité de ética responsable de la Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alimentaria y Pesca de Mecklemburgo-Pomerania Occidental (LALLF MV) y obtuvieron la aprobación gubernamental con el número de registro LVL MV TSD/7221.3-1. -041/20. Este proyecto también obtuvo la autorización de la Oficina del Programa de Uso y Cuidado de Animales de los CDC.

Para la generación de ratones con activación de hACE2, se generó la línea de activación de hACE2 (B6) (B6.Cg-Ace2tm1(ACE2)Dwnt/J) mediante mutagénesis dirigida para expresar el ADNc de ACE2 humano en lugar del gen Ace2 de ratón. Por lo tanto, en este modelo de ratón, la expresión de hACE2 está regulada por los elementos potenciadores y promotores endógenos de Ace2 de ratón. El vector de direccionamiento (WEN1-HR) tenía ADNc de ACE2 humano insertado en marco con el codón de iniciación endógeno del ratón Ace2 (Datos ampliados, figura 3a). El ADNc humano estaba flanqueado por un casete FRT-neomicina-FRT-loxP y un sitio loxP distal. Se utilizó WEN1-HR para transfectar células madre embrionarias 129Sv/Pas y se aislaron y examinaron 837 clones de células madre embrionarias para determinar su recombinación homóloga mediante PCR y transferencia Southern. Se identificaron once clones de células madre embrionarias adecuadamente recombinados, y algunos de ellos se utilizaron para la inyección e implantación de blastocistos en ratones hembra para generar 22 ratones fundadores macho con quimerismo (129Sv/Pas:C57BL/6) que oscilaba entre el 50 y el 100 %. Para completar la activación de hACE2, cruzamos los ratones macho quiméricos con ratones hembra que expresan C57BL/6J Flp para escindir el casete de selección de neomicina flanqueado por FRT y generar el alelo ACE2 humanizado floxed (Datos ampliados, Fig. 3a). Estos ratones knock-in para hACE2 se identificaron mediante PCR y se confirmaron mediante transferencia Southern y se retrocruzaron con ratones C57BL/6J durante siete generaciones antes de este estudio. Esta línea ha sido donada a The Jackson Laboratory para uso de la comunidad científica (stock 035000).

Se obtuvieron ratones hembra heterocigotos hACE2 knock-in de The Jackson Laboratory y los ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J fueron de Janvier Lab. Todos los ratones fueron aclimatados durante al menos 2 semanas en jaulas ventiladas individualmente (línea azul, Tecniplast), con ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, temperatura ambiente de 22 ± 1 °C y humedad del 50 ± 5 %, agua acidificada en autoclave. , jaulas esterilizadas en autoclave que incluyen comida, ropa de cama y enriquecimiento ambiental en las instalaciones libres de patógenos específicos del Instituto de Virología e Inmunología (Mittelhäusern). Una semana antes de la infección, los ratones se colocaron en aisladores individuales con filtro HEPA (IsoCage N, Tecniplast). Se anestesiaron ratones (de 10 a 12 semanas de edad) con isoflurano y se infectaron por vía intranasal con 20 µl (es decir, 10 µl por fosa nasal) con una proporción de 1:1 de las variantes del SARS-CoV-2 (tipo salvaje y hACE2 knock-in). ratones) o medio de cultivo simulado (sólo ratones silvestres). Después de la infección intranasal, los ratones fueron monitoreados diariamente para detectar la pérdida de peso corporal y los signos clínicos. Se recogieron hisopos de garganta diariamente bajo anestesia breve con isoflurano utilizando hisopos estériles ultrafinos (Hydraflock, Puritan, 25-3318-H). Las puntas de los hisopos se colocaron en 0,5 ml de tampón de lisis RA1 (Macherey-Nagel, ref. 740961) suplementado con β-mercaptoetanol al 1% y se agitaron con vórtex. Se sacrificaron grupos de ratones de dos experimentos independientes los días 2 y 4 después de la infección y se diseccionaron asépticamente los órganos, evitando la contaminación cruzada. Se realizó un muestreo sistemático de tejido: (1) se recogieron el lóbulo superior derecho del pulmón, la cornisa nasal derecha, el bulbo olfatorio derecho, parte del hemisferio cerebral derecho, la parte apical del riñón derecho y partes del intestino delgado distal (íleon) para el aislamiento del ARN. en tampón de lisis RA1; (2) se recogieron en MEM los lóbulos medio, inferior y poscava del pulmón, la cornisa nasal izquierda, el bulbo olfatorio izquierdo, parte del hemisferio derecho del cerebro y parte del riñón derecho; y (3) el lóbulo izquierdo del pulmón, el lóbulo izquierdo del hígado, el riñón izquierdo, el hemisferio cerebral izquierdo y parte del yeyuno y el íleon se fijaron en formalina tamponada. Los datos se generaron a partir de dos experimentos independientes diseñados idénticamente.

Las muestras de tejido de ratón recogidas en tampón de lisis RA1 suplementado con β-mercaptoetanol al 1% se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de tejidos Bullet Blender (Next-Advance). Los homogeneizados se centrifugaron durante 3 minutos a 18.000 gy se almacenaron a -70 ° C hasta su procesamiento. El ARN total se extrajo de los homogeneizados utilizando el kit NucleoMag VET para ARN y ADN viral y bacteriano de muestras veterinarias (Macherey Nagel, ref. 744200) y el instrumento de extracción automatizado KingFisher Flex (ThermoFisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza del ARN se analizó con un NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific). Se llevó a cabo una RT-PCR de 25 μl para el gen E viral utilizando 5 μl de plantilla de ARN extraída utilizando la RT-PCR AgPath-ID One-Step (Applied Biosystems). Las muestras se procesaron por duplicado. La amplificación y detección se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystem 7500 en las siguientes condiciones: una transcripción inversa inicial a 45 °C durante 10 min, seguida de una activación de PCR a 95 °C durante 10 min y 45 ciclos de amplificación (15 s a 95 °C, 30 s a 56 °C y 30 s a 72 °C).

Se procesaron, seccionaron y tiñeron muestras de tejido de ratón fijadas con hematoxilina y eosina en las instalaciones centrales de COMPATH (Universidad de Berna). Un patólogo veterinario certificado (SdB), que desconocía la identidad de las muestras, examinó y calificó portaobjetos histopatológicos de pulmón de ratones knock-in para hACE2 y ratones de tipo salvaje (infectados y simulados). Los criterios de puntuación se detallan en la Tabla complementaria 4.

Seis hámsteres sirios (Mesocricretus auratus) (Janvier Labs) se infectaron por vía intranasal bajo anestesia por inhalación de corta duración con 70 μl de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 en proporciones iguales utilizando 104,77 TCID50 por hámster (calculado a partir de la titulación inversa de el material original). Después de 24 h de alojamiento aislado en jaulas ventiladas individualmente, se alojaron seis parejas (cada una con un hámster donante inoculado directamente y un hámster de contacto inoculado simuladamente). El alojamiento de cada pareja de hámster estaba estrictamente separado en sistemas de jaulas individuales para evitar el desbordamiento entre diferentes parejas. Durante los siguientes siete días (del día 2 al día 8 después de la infección) y el día 12 después de la infección, se controló la eliminación viral además de un examen físico diario y una rutina de pesaje corporal.

Para evaluar la eliminación viral, se recogieron lavados nasales individualmente de cada hámster bajo anestesia de isoflurano a corto plazo. Comenzando con el hámster de contacto de cada par, se enjuagó cada fosa nasal con 100 µl de PBS (1,0 x solución salina tamponada con fosfato) y se recogió inmediatamente el reflujo. Se utilizó una nueva punta de pipeta para cada fosa nasal y hámster para evitar la transmisión indirecta de un hámster a otro. Además, entre las respectivas parejas, se utilizó un nuevo sistema de anestesia para cada pareja de hámsteres. El día 8 después de la infección, se encontró muerto a un hámster de contacto. Aunque perdieron hasta casi el 20% de su peso corporal, uno de cada dos hámsters se recuperó de la enfermedad. Bajo eutanasia, se recogieron muestras de suero de cada hámster.

Para la configuración experimental de infección de un solo virus, se infectaron siete hámsters cada uno por vía intranasal con 105,1 TCID50 por hámster de SARS-CoV-2D614, o 104,5 TCID50 por hámster de SARS-CoV-2G614 (calculado a partir de la titulación inversa del material original). ). Desde el día 1 al día 4, se obtuvieron lavados nasales de estos hámsteres y se registraron los cambios de peso corporal. Después de la eutanasia, se recogió de estos hámsteres un panel de tejido de los órganos respiratorios, incluidos los cornetes nasales, el tejido traqueal, las porciones craneal, medial y caudal del pulmón derecho y el ganglio linfático pulmonar.

Según el estudio con hámsteres, doce hurones (Mustela putorius furo) criados en casa se dividieron en seis grupos de dos individuos. Las parejas de hurones tenían la misma edad (entre 4 y 18 meses). En total, cuatro hurones eran hembras (dos parejas) y ocho hurones eran machos o machos castrados (cuatro parejas). El alojamiento de cada pareja de hurones estaba estrictamente separado en sistemas de jaulas individuales, para evitar el desbordamiento entre diferentes parejas. Por jaula separada, se inoculó un hurón individual por vía intranasal mediante la instilación de 125 μl del inóculo antes mencionado (105,4 TCID50 por hurón, calculado a partir de la titulación inversa del material original igualmente mezclado) en cada fosa nasal bajo una anestesia por inhalación de corta duración a base de isoflurano. Los puntos de tiempo y la técnica de muestreo correspondieron a los métodos utilizados para los hámsteres, aunque el lavado nasal de los hurones se realizó utilizando 2 × 700 µl de PBS por hurón. El hurón de contacto no fue inoculado.

Las muestras de órganos se homogeneizaron en una mezcla de 1 ml de volúmenes iguales compuesta de sales equilibradas MEM de Hank y sales equilibradas MEM de Earle que contenían 2 mM de l-glutamina, 850 mg l-1 de NaHCO3, 120 mg l-1 de piruvato de sodio suplementado con 10% de feto de ternero. suero y penicilina-estreptomicina al 1% a 300 Hz durante 2 minutos usando un Tissuelyser II (Qiagen) y se centrifugó para aclarar el sobrenadante. El ácido nucleico se extrajo de 100 µl de los lavados nasales después de un breve paso de centrifugación o del sobrenadante de la muestra de órgano utilizando el kit NucleoMag Vet (Macherey Nagel). Las cargas virales en estas muestras se determinaron utilizando nCoV_IP4 RT-PCR27, incluido el ARN estándar que se cuantificó de forma absoluta mediante PCR de gotas digitales con una sensibilidad de 10 copias por reacción. Posteriormente, el ARN extraído se sometió a secuenciación MinION y PCR digital en gotas. Para la secuenciación de MinION, se produjeron amplicones con cebadores (WU-21-F: AATCTATCAGGCCGGTAGCAC; WU-86-R: CAACAGCTATTCCAGTTAAAGCAC) utilizando RT-PCR de un solo paso SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific). Los amplicones se secuenciaron en un sistema MinION de Oxford Nanopore utilizando códigos de barras nativos 1–12 (EXP-NBD104) y 13–24 (EXP-NBD114), respectivamente, con el kit de ligadura SQK-LSK109 (Oxford Nanopore). Las bibliotecas se cargaron en celdas de flujo R9.4.1 (FLO-MIN106D) en un MinION acoplado a un MinIT. El análisis de datos MinION se realizó como se describe en "Secuenciación y análisis computacional".

Para el análisis de secuencias y mutaciones raras basado en PCR de gotas digitales, se utilizó el sistema de PCR digital de gotas QX200 de Bio-Rad. Se aplicó el kit avanzado One-Step RT-ddPCR para sondas (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para la amplificación de un fragmento de 86 pb de ambas variantes de S se utilizó el cebador directo SARS2-S-1804-F (5′-ACA AAT ACT TCT AAC CAG GTT GC-3′) y el cebador inverso SARS2-S-1889 -R (5′-GTA AGT TGA TCT GCA TGA ATA GC-3′). Para la detección de las variantes D y G en una muestra, se aplicaron dos sondas de ácido nucleico bloqueadas específicas de alelo: SARS2-S-v1D-1834FAM (5′-FAM-TaT cAG gat GTt AAC-BHQ1-3′) y SARS2 -S-v3G-1834HEX (5′-HEX-T cAG ggt GTt AAC-BHQ1-3′) (las posiciones de ácido nucleico bloqueadas están en minúsculas). La concentración de los cebadores y sondas fue de 20 µM y 5 µM, respectivamente. Para el análisis de los datos se utilizó el software QuantaSoft Analysis Pro (v.1.0.596).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este documento.

Los datos de secuencia están disponibles en NCBI Sequence Read Archive (SRA) con el número de acceso de BioProject PRJNA669553. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNF) (subvenciones 31CA30_196644, 31CA30_196062 y 310030_173085), la Comisión Europea (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network 'HONOURS'; acuerdo de subvención nº 721367 y el proyecto Horizonte 2020 'VEO ' acuerdo de subvención nº 874735), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) (subvención RAPID, nº 01KI1723A) y por fondos básicos de la Universidad de Berna y el Ministerio Federal de Alimentación y Agricultura de Alemania. Los ratones hACE2 knock-in (B6) se generaron con el apoyo de NIH/NIAID P01AI059576 (subproyecto 5) y el apoyo parcial de NIH/NIAID U54-AI-057158. El Grupo de Trabajo COVID-19 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. brindó apoyo parcial. Este trabajo fue apoyado por fondos especiales COVID-19 de la Oficina Federal Suiza de Salud Pública y de la Oficina Federal Suiza de Seguridad Alimentaria y Asuntos Veterinarios, y agradecemos a A. Summerfield por su ayuda para obtener fondos del gobierno suizo. Agradecemos a la plataforma NGS de la Universidad de Berna; M. Lange, C. Korthase, M. Currie, G. Larson y S. Renzullo por su excelente asistencia técnica; y F. Klipp, D. Fiedler, H. Manthei, C. Lipinski, J. Tang y A. Godel por su inestimable apoyo en los experimentos con animales. Esta actividad fue revisada por los CDC y se llevó a cabo de manera consistente con las leyes federales aplicables y las políticas de los CDC: 45 CFR parte 46, 21 CFR parte 56; 42 USC Sección. 241(d); 5 Sección del USC. 552a; 44 USC Sección. 3501 y siguientes. Los hallazgos y conclusiones de este artículo son responsabilidad de los autores y no necesariamente representan la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bin Zhou, Tran Thi Nhu Thao, Donata Hoffmann, Adriano Taddeo

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Charaf Benarafa, David E. Wentworth, Volker Thiel, Martin Beer

Respuesta de los CDC a la COVID-19, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE. UU.

Bin Zhou, Xiaoyu Fan, Li Wang, Jaber Hossain, Malania M. Wilson, Matthew W. Keller, Thomas J. Stark, John R. Barnes y David E. Wentworth

Instituto de Virología e Inmunología (IVI), Mittelhäusern, Suiza

Tran Thi Nhu Thao, Adriano Taddeo, Nadine Ebert, Silvio Steiner, Jenna N. Kelly, Jasmine Portmann, Lisa Thomann, Hanspeter Stalder, Ronald Dijkman, Charaf Benarafa y Volker Thiel

Departamento de Enfermedades Infecciosas y Patobiología, Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Tran Thi Nhu Thao, Adriano Taddeo, Nadine Ebert, Fabien Labroussaa, Silvio Steiner, Jenna N. Kelly, Jasmine Portmann, Bettina Salome Trüeb, Lisa Thomann, Hanspeter Stalder, Ronald Dijkman, Joerg Jores, Charaf Benarafa y Volker Thiel

Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Tran Thi Nhu Thao y Silvio Steiner

Instituto de Virología Diagnóstica, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Alemania

Donata Hoffmann, Anne Pohlmann, Jacqueline King, Nico Joel Halwe, Lorenz Ulrich, Bernd Hoffmann y Martin Beer

Instituto de Bacteriología Veterinaria, Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Fabien Labroussaa, Bettina Salomé Trüeb y Joerg Jores

Instituto Conmemorativo Battelle, Atlanta, GA, EE. UU.

Xudong Lin y Dan Cui

Instituto de Biología Celular, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Berta Pozzi

COMPATH, Instituto de Patología Animal, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Simone de Brot

Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación, Oak Ridge, Tennessee, EE. UU.

Nannan Jiang

Instituto de Enfermedades Infecciosas, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Ronald Dijkman

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VT, DEW, MB y CB concibieron el estudio. TTNT, BZ, DH y AT realizaron la mayoría de los experimentos. NE, SS, FL, JNK, HS, JP, BST, JJ, RD, DH, NJH, LU, JK, BP, AP, BH, XF, XL, LW, Nueva Jersey, DC, JH, MMW, MWK, TJS, JRB, SdB y CB realizaron trabajos experimentales y/o proporcionaron sistemas experimentales, análisis de datos y reactivos esenciales. VT, DEW, MB, CB, TTNT, BZ, NE, SS, LT, DH, NJH y LU escribieron el manuscrito y realizaron las figuras. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Charaf Benarafa, David E. Wentworth, Volker Thiel o Martin Beer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información de revisión por pares Nature agradece a Stanley Perlman y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Afinidad entre S y hACE2 determinada por interferometría de biocapa. Se cargó hACE2 marcado con Fc en la superficie de biosensores de captura de Fc antihumanos y la asociación se realizó utilizando S (S-614D) o S(D614G) (S-614G) seguido de disociación. Los datos representan tres réplicas biológicas, y todas las repeticiones con análisis estadístico se proporcionan en la Tabla complementaria 2. b, Unión de S1 marcada con polihistidina o marcada con Fc a células BHK-hACE2, determinada por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media se muestra para la concentración de proteína S1 correspondiente. Los datos son media ± DE de tres réplicas biológicas. c, Replicación de los aislados SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (aislado 614D) y SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/2020 (aislado 614G) en células NBE humanas a 33 °C (izquierda), 37 °C (centro) y 39 °C (derecha). Se infectaron células NBE humanas con 200.000 TCID50 de cada virus. Los sobrenadantes se recogieron cada 24 h y se titularon mediante el ensayo TCID50. Los datos son media ± DE de cuatro réplicas. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student bilateral no pareada sin ajustes para comparaciones múltiples. Valores de p (de izquierda a derecha): izquierda, NS (no significativo), P = 0,8098; NS, p = 0,7874; *P = 0,0328; NS, p = 0,1887; y NS, P = 0,5296; medio, NS, P = 0,1689; NS, p = 0,1475; NS, p = 0,1415; **P = 0,0033; y NS, P = 0,3184; derecha, *P = 0,0197; NS, p = 0,6018; NS, P = 0,3903; NS, P = 0,0898; y *P = 0,0445. d, Ensayo de competencia de SARS-CoV-2D614 (614D) y SARS-CoV-2G614 (614G) recombinantes en células NBE humanas a 33 °C, 37 °C y 39 °C. El inóculo se preparó mezclando dos virus en una proporción de 9:1 basada en UFP por ml. Se infectaron células NBE humanas con 100.000 UFP de la mezcla de virus 9:1 (n = 4). El ARN viral se extrajo del sobrenadante diario y se secuenció mediante NGS. Porcentaje de lecturas de secuenciación que codifican S o S(D614G). Cada cuadrado representa un punto de datos individual en el experimento de competencia. Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal basado en los recuentos de lectura de secuencia para S y S(D614G), y se calcularon los valores de P para el coeficiente del grupo (variante). Valores de p (de izquierda a derecha): izquierda, NS, P = 0,1796; NS, P = 0,087; NS, p = 0,1147; NS, p = 0,1244; y *P = 0,0401; medio, NS, P = 0,9114; NS, P = 0,0715; NS, p = 0,1696; NS, p = 0,1696; y NS, P = 0,1657; derecha, NS, P = 0,1041; *P = 0,013; NS, P = 0,0645; *P = 0,0102; y *P = 0,0308. e, Gráfico de ojo de gato que ilustra los valores relativos de aptitud replicativa del SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614 en células NBE humanas para los experimentos de competencia realizados en d. Cada punto representa un punto de datos individual, la línea central representa la media y el área sombreada representa la sd

Datos fuente

a, b, Gráficos de ojo de gato que ilustran los valores relativos de aptitud replicativa del SARS-CoV-2D614 sobre el SARS-CoV-2G614 en células epiteliales nasales humanas (a) y NBE humanas (b) para los experimentos de competencia que se muestran en la Fig. 1e, f. . Cada punto representa un punto de datos individual, la línea central representa la media y el área sombreada representa la sd

Datos fuente

a, Diseño y generación de ratones knock-in hACE2. El ADNc de ACE2 humano se insertó en marco con el codón de iniciación endógeno de Ace2 de ratón en el exón 2, que se eliminó. El ADNc de ACE2 humano estaba flanqueado en 5' con un sitio loxP (triángulo negro) y en 3' con un casete FRT-neomicina-FR-loxP. La construcción de direccionamiento incluía un casete de selección negativa (PGK-DTA) para mejorar la selección de clones con recombinación homóloga. Se cruzaron ratones macho quiméricos que transmitían el locus objetivo con ratones hembra eliminadores de Flp para generar el alelo activador ACE2 humano floxed. Este alelo se puede utilizar: (1) sin más recombinación mediada por Cre (como se muestra aquí) para estudiar ratones knock-in hACE2, en los que el ADNc de ACE2 humano se expresa en lugar de Ace2 de ratón; (2) después de cruzar con una línea de ratón Cre-delter para generar ratones constitutivos con desactivación de Ace2; y (3) después del cruce con una línea Cre específica de tejido. Se pueden cruzar ratones knockout ubicuos y específicos de tejido con ratones transgénicos hACE2 convencionales para eliminar el ACE2 endógeno de ratón, lo que podría confundir los estudios de patogénesis (debido a la heterodimerización de ACE2). b, Pérdida de peso corporal en los momentos indicados después de la infección de ratones knock-in para hACE2 (n = 8) y ratones de tipo salvaje (n = 9), y para ratones de tipo salvaje con infección simulada muestreados de manera idéntica (n = 10) . c, d, análisis RT-qPCR (c) y títulos virales (d) de homogeneizados de tejido de ratones knock-in hACE2 y de tipo salvaje inoculados en los momentos indicados. Olf., olfativo. e, Porcentaje de lecturas de secuenciación que codifican S o S (D614G). Cada cuadrado representa datos de un ratón individual en un experimento de competencia. Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal sobre la base de los recuentos de lectura de secuencia para S y S (D614G). Los valores de p se calcularon para el coeficiente de grupo (variante). Valores de p (de izquierda a derecha): ***P = 0,0009; **P = 0,0020; NS, p = 0,7875; y *P = 0,0180. f, Gráfico de ojo de gato que ilustra los valores relativos de aptitud replicativa del SARS-CoV-2D614 sobre el SARS-CoV-2G614 a partir de hisopos orofaríngeos de ratones knock-in hACE2 en el experimento de competencia que se muestra en la Fig. 2. Proporciones de SARS-CoV-2G614 a El SARS-CoV-2D614 se midió después de la competencia utilizando la plataforma de secuenciación MinION en el momento indicado en el gráfico. Cada punto representa un ratón infectado con hACE2, la línea central representa la media y el área sombreada representa la sd.

Datos fuente

a, Pérdida de peso corporal en los momentos indicados después de la infección de hámsteres sirios. Los hámsteres donantes (n = 6) (puntos negros) fueron inoculados por vía intranasal con SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614 en proporciones iguales (1 × 104,77 TCID50 por hámster, según lo determinado mediante valoración inversa del inóculo original). Veinticuatro horas después de la infección, se alojaron hámsteres ingenuos (n = 6) (triángulos naranjas) en contacto directo en una configuración experimental uno a uno. b, análisis RT-qPCR de muestras de lavado nasal individuales obtenidas de hámsteres donantes y de contacto. c, Pérdida de peso corporal en los momentos indicados después de la infección de los hámsteres. Los hámsteres sirios fueron inoculados con 105,1 TCID50 por hámster de SARS-CoV-2D614 (n = 7) (puntos azules) o 104,5 TCID50 por hámster de SARS-CoV-2G614 (n = 7) (triángulos rojos) por vía intranasal. Los títulos se determinaron mediante valoración inversa del material de inoculación original. d, Los números de copias del genoma viral se muestran determinados por RT-qPCR a partir de muestras de lavado nasal individuales de hámsteres inoculados con una variante única del virus. e, análisis RT-qPCR de homogeneizados de tejido de hámsteres inoculados del grupo SARS-CoV-2D614 (n = 7) (puntos azules) versus el grupo SARS-CoV-2G614 (n = 7) (triángulos rojos). f, Porcentaje de lecturas de secuenciación que codifican S o S (D614G). Cada cuadrado representa datos de un hámster individual en el experimento de competencia. Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal sobre la base de los recuentos de lecturas de secuenciación para S y S(D614G). Los valores de p se calcularon para el coeficiente de grupo (variante). ***P = 0,0007; ****P < 0,0001. g, Gráfico de ojo de gato que muestra los valores relativos de aptitud replicativa del SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614 para hámsteres infectados del experimento de competencia que se muestra en la Fig. 3. Las proporciones de SARS-CoV-2G614 a SARS-CoV-2D614 fueron medido después de la competencia utilizando la plataforma de secuenciación MinION en los puntos de tiempo indicados en la gráfica. Cada punto representa un hámster infectado (n = 6), la línea central representa la media y el área sombreada representa la DE

Datos fuente

A los hurones donantes (puntos negros) (n = 6) se les inoculó por vía intranasal con 105,4 TCID50 por hurón, según lo determinado mediante titulación inversa de un inóculo que comprendía proporciones iguales de SARS-CoV-2D614 y SARS-CoV-2G614. Veinticuatro horas después de la inoculación, un hurón de contacto (triángulo naranja) (n = 6) se mezcló con un hurón donante, creando seis pares de hurón donante-contacto. a, Se representa el peso corporal individual de los hurones en los días indicados en relación con el día de la inoculación. b, Números de copias del genoma de donantes inoculados y hurones de contacto. Se analizaron muestras de lavado nasal individuales de los días indicados mediante RT-qPCR nCoV_IP4 y se calcularon números absolutos utilizando un conjunto de ARN estándar. Todos los hurones donantes (puntos negros) dieron positivo para ARN viral, a partir del día 2 después de la inoculación (n = 6). Cuatro de seis hurones en contacto (triángulos naranjas) dieron positivo en ARN viral, a partir del día 4 (correspondiente al día 3 después del contacto). Dos de los seis hurones de contacto nunca dieron positivo en la prueba de ARN viral durante todo el estudio. c, Porcentaje de lecturas de secuenciación que codifican S o S (D614G). Cada cuadrado representa datos de un hurón individual en el experimento de competencia. Para cada punto temporal, se generó un modelo de regresión lineal sobre la base de los recuentos de lectura de secuencia para S y S (D614G). Los valores de p se calcularon para el coeficiente de grupo (variante). Valores de p (de izquierda a derecha): ***P = 0,0001; **P = 0,0090; **P = 0,0030; *P = 0,0352; *P = 0,0393; *P = 0,0411; y NS, P = 0,2883. d, Gráfico de ojo de gato que ilustra los valores relativos de aptitud replicativa del SARS-CoV-2G614 sobre el SARS-CoV-2D614 en hurones infectados del experimento de competencia que se muestra en la Fig. 4. Las proporciones de SARS-CoV-2G614 a SARS-CoV-2D614 fueron medido después de la competencia utilizando la plataforma de secuenciación MinION en los puntos de tiempo indicados en la gráfica. Cada punto representa un hurón infectado (n = 6), la línea central representa la media y el área sombreada representa la DE

Datos fuente

Unión de SARS-CoV-2 S1-614D marcado con Fc a células BHK de tipo salvaje y células BHK que expresan hACE2 exógena.

Estrategia de activación para datos de citometría de flujo.

Una lista de cebadores utilizados en este estudio.

Afinidad entre S1 y hACE2 determinada por interferometría de biocapa.

Patología de ratones.

Puntuaciones de patología de ratones.

Reimpresiones y permisos

Zhou, B., Thao, TTN, Hoffmann, D. et al. El cambio del pico D614G del SARS-CoV-2 mejora la replicación y la transmisión. Naturaleza 592, 122-127 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03361-1

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Recibido: 15 de octubre de 2020

Aceptado: 16 de febrero de 2021

Publicado: 26 de febrero de 2021

Fecha de emisión: 01 de abril de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03361-1

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