El estrés oxidativo afecta de manera diferencial la secreción apical y basolateral de factores angiogénicos de las iPSC humanas

Aug 23, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 12694 (2022) Citar este artículo

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El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa polarizada que secreta factores de crecimiento y citocinas hacia la retina en sentido apical y la coroides en sentido basolateral. Numerosas proteínas secretadas por el EPR se han relacionado con la patogénesis de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). El propósito de este estudio fue determinar el secretoma apical y basolateral diferencial de las células del EPR y los efectos del estrés oxidativo en la secreción direccional de proteínas vinculadas a la DMAE y la angiogénesis. Se utilizó espectrometría de etiquetas de masa en tándem para perfilar proteínas en medios condicionados apicales y basolaterales de iPSC-RPE humanos. Los cambios en la secreción después del estrés oxidativo inducido por H2O2 o hidroperóxido de terc-butilo (tBH) se investigaron mediante ELISA y análisis Western. De 926 proteínas secretadas diferencialmente, 890 (96%) eran más apicales. El estrés oxidativo alteró la secreción de múltiples factores implicados en la DMAE y la neovascularización y promovió un microambiente proangiogénico al aumentar la secreción de moléculas proangiogénicas (VEGF, PTN y CRYAB) y disminuir la secreción de moléculas antiangiogénicas (PEDF y CFH). ). La secreción apical se vio más afectada que la basolateral para PEDF, CRYAB y CFH, mientras que la secreción basolateral se vio más afectada para VEGF, lo que puede tener implicaciones para la neovascularización coroidea. Este estudio sienta las bases para las investigaciones de la secreción disfuncional de proteínas polarizadas del EPR en la DMAE y otros trastornos degenerativos coriorretinianos.

A pesar de los avances en los tratamientos, la DMAE sigue siendo la principal causa de ceguera en los Estados Unidos en adultos mayores de 651 años. Aunque se debaten los mecanismos patogénicos primarios de la DMAE, la enfermedad se caracteriza a nivel celular por disfunción del EPR y estrés metabólico, acumulación de depósitos sub-RPE, muerte de fotorreceptores suprayacentes y muerte de células endoteliales coroideas subyacentes y adelgazamiento coroideo posterior. El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es un prolífico secretor de factores de crecimiento y citocinas de forma polarizada hacia los fotorreceptores del lado apical y la vasculatura coroidea del lado basolateral. Las alteraciones en la secreción de proteínas direccionales del EPR se han implicado en la degeneración coriorretiniana, incluida la DMAE2. Estos estudios previos muestran que las células del EPR secretan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que promueve la angiogénesis, hacia la coroides, y factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), que inhibe la angiogénesis, hacia los fotorreceptores3. Las células del EPR también secretan direccionalmente proteínas adicionales con alelos de riesgo de DMAE, como el factor H del complemento y la fibulina 5,2,4. Además, el EPR demuestra la secreción direccional de proteínas codificadas por genes de la enfermedad mendeliana, como TIMP3 y EFEMP1, que causan la distrofia macular de Sorsby y la distrofia macular en panal de Doyne, respectivamente5,6.

El secretoma polarizado de las células del EPR no se ha documentado completamente y aún se desconoce qué proteínas secretadas por el EPR adicionales pueden afectar la salud de la retina y la coroides. Muchos estudios previos del secretoma del EPR han utilizado cultivos celulares convencionales en pocillos de plástico y, por lo tanto, han investigado solo medios condicionados apicales y no han capturado proteínas secretadas basolaterales, que pueden afectar tanto a la neovascularización coroidea como a la degeneración coroidea en la atrofia geográfica7,8,9. Estudios más recientes han investigado la secreción de proteínas tanto apical como basolateral, ya que comprender el secretoma polarizado diferencial de las células del EPR es fundamental para las investigaciones de la secreción de proteínas disfuncional en la DMAE y otras enfermedades degenerativas coriorretinianas10,11. El propósito de este estudio es investigar más a fondo la secreción direccional de proteínas del EPR y cómo el estrés oxidativo puede afectar la secreción polarizada de proteínas importantes en la DMAE. Se cultivó una línea RPE derivada de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) sobre soportes permeables, lo que permitió evaluar el perfil apical y basolateral de las proteínas secretadas, centrándose específicamente en aquellas proteínas que se sabe que funcionan extracelularmente y, por lo tanto, afectan potencialmente a los fotorreceptores adyacentes y a la coroides. vasculatura. Utilizando modelos de estrés oxidativo con H2O2 e hidroperóxido de terc-butilo (tBH), demostramos cambios en la secreción direccional de proteínas del EPR que podrían contribuir a la neovascularización.

Las células RPE derivadas de iPSC (iPSC-RPE) se mantuvieron sobre soportes permeables y se utilizaron entre 2 y 6 meses después del paso. iPSC-RPE tuvo una pigmentación de melanina apropiada y una morfología de adoquines y un aumento en TEER a partir de las 2 semanas posteriores al pasaje, con una meseta en un promedio de 312 Ω cm2 a las 8 semanas (Fig. 1A, B). Las células mostraron expresión de marcadores del RPE y localización apropiada de proteínas de membrana (Fig. 1C, D). Las células iPSC-RPE se mantuvieron en medios sin suero que contenían un suplemento de B27 con albúmina. Para analizar el secretoma mediante espectrometría de masas, sin que grandes cantidades de albúmina confundan los resultados, se formuló un suplemento de B18 similar al B27 sin albúmina. iPSC-RPE en medios suplementados con B18 mantuvo el TEER durante la noche similar a los medios estándar suplementados con B27 (Figura complementaria 1).

El iPSC-RPE humano demuestra polaridad y diferenciación apropiadas, (A) con pigmentación de melanina y morfología de adoquines, (B) y aumento de TEER después del paso a filtros Transwell. N = 6–65 réplicas biológicas según el momento, sin réplicas técnicas. Los puntos de datos muestran la media ± DE. (C) RT-PCR de marcadores de RPE en iPSC-RPE 11 semanas después del pase en comparación con células RPE humanas adultas primarias y ARPE19 a las 4 semanas y 8 meses después del pase (las imágenes sin recortar se muestran en la figura complementaria 3). (D) ICC de iPSC-RPE para ZO-1 en uniones estrechas y CD147, Ezrin y Kir7.1 en la membrana apical. La faloidina es roja y DAPI es azul. La tinción se muestra antes (control) y después (post-H2O2) de la exposición a 800 µM H2O2 durante 24 h.

Se recogió medio B18 condicionado y se concentró después de 16 h desde las cámaras apicales y basolaterales de conjuntos de pocillos por triplicado y se realizó espectrometría de etiquetas de masa en tándem. El diseño experimental se ilustra en la figura complementaria 2. Para tener en cuenta la diferencia de volumen entre las cámaras apicales y basolaterales, los recuentos brutos de la espectrometría de masas se ajustaron de acuerdo con el factor de concentración, para comparar la cantidad total de cada proteína secretada apicalmente versus basolateralmente. Se identificaron un total de 1421 proteínas secretadas. Utilizando criterios de al menos el doble de diferencia y un valor de p <0,05 (ajustado para la tasa de descubrimiento falso), 926 proteínas tuvieron una secreción diferencial entre los compartimentos apical y basolateral. Para la reproducibilidad, se obtuvo un segundo conjunto de datos utilizando 4 conjuntos de pocillos replicados, utilizando volúmenes iguales de medio (800 ml) en las cámaras apical y basolateral. El segundo conjunto de datos mostró una congruencia general con el primero. Se identificaron un total de 1320 proteínas secretadas (en comparación con 1421) y 732 proteínas mostraron una secreción direccional diferencial (en comparación con 926). La menor cantidad de proteínas se debe a valores faltantes, lo que es más probable a medida que aumenta el número de muestras. En general, el 87% (637/732) de las proteínas secretadas diferencialmente en el conjunto de datos 2 se secretaron más apicalmente (Fig. 2A). El número promedio de péptidos únicos por proteína fue de 4,2 en el conjunto de datos 1 frente a 4,8 en el conjunto de datos 2 (p <0,01). Dado el mayor número de réplicas y el mayor número de péptidos únicos detectados por proteína, se utilizó el conjunto de datos 2 para las Tablas 1, 2, 3. El análisis de rutas utilizando Advaita iPathwayGuide demostró que las funciones moleculares que involucran la unión del ácido nucleico y del sustrato del ácido nucleico, así como La actividad GTPasa se enriqueció significativamente en las proteínas secretadas diferencialmente (Fig. 2B)12,13. Las proteínas G y la actividad GTPasa son importantes en numerosos procesos celulares, incluido el ciclo visual y el tráfico de membranas, y las proteínas detectoras de ácidos nucleicos en las células del EPR pueden ser importantes en la inflamación y la degeneración macular relacionada con la edad14.

El secretoma polarizado iPSC-RPE humano es más apical que basolateral. (A) Gráfico de volcán del conjunto de datos 2 que muestra proteínas con al menos el doble de cambio y p <0,05, en azul (más basolateral) o rojo (más apical). N = 4 réplicas biológicas. Las 3 proteínas secretadas de forma más diferencial tanto en el compartimento apical como en el basolateral, así como las proteínas de interés como se describe en la sección de resultados, están etiquetadas con números en el gráfico: 1. RNF7, 2. TIMP3, 3. UBR, 4. PTPN22 , 5. CFI, 6. VEGF, 7. C1QTNF5, 8. PTN, 9. HTRA1, 10. CFH, 11. PEDF, 12. RPL12, 13. HMGN2, 14. CRYAB, 15. PSMA1. (B) Dendrograma del conjunto de datos 2 que muestra funciones moleculares que se representaron diferencialmente en muestras apicales frente a basolaterales (p <0,05, ajustado para la tasa de descubrimiento falso). El análisis se realizó utilizando Advaita Bio ipathwayguide12,13.

Para considerar los efectos potenciales de las proteínas secretadas por el EPR en los tejidos adyacentes (la retina neurosensorial y la vasculatura coroidea), la atención se centró en las "proteínas efectoras", aquellas que se sabe que funcionan extracelularmente y de forma no autónoma, excluyendo así principalmente las proteínas intracelulares que se secretan como desechos o excedentes celulares. Incluimos las categorías de factores de crecimiento y citoquinas, proteasas, inhibidores de proteasas, componentes de la matriz extracelular, proteínas de la cascada del complemento y proteínas de la homeostasis lipídica. Se utilizó la anotación en Advaita para identificar proteínas en cada categoría y se cruzó con UniProt para identificar proteínas extracelulares (Tabla 1)12,15. La categoría más grande de proteínas fueron las proteasas. De manera similar a la tendencia general del secretoma polarizado que se ve en la Fig. 2A, la inmensa mayoría de estas proteínas se secretaron apicalmente más que basolateralmente.

Las células del EPR secretaron varios genes de enfermedades conocidas, como se muestra en la Tabla 2. Los genes de la enfermedad mendeliana que se secretaron de manera diferencial se identificaron mediante anotaciones en Advaita, y en la Tabla 2 también se incluyen loci de riesgo de DMAE adicionales. Un importante inhibidor de la proteasa, TIMP3, se secretó diez veces más en la cámara basolateral (p <0,01). Las mutaciones en TIMP3 causan distrofia macular de Sorsby, una distrofia macular autosómica dominante con atrofia macular de aparición temprana y neovascularización coroidea agresiva grave. También se han identificado alelos de riesgo de DMAE en TIMP316. La degeneración retiniana de aparición tardía (LORD), una enfermedad con degeneración coriorretiniana del polo posterior en la edad adulta tardía, es causada por mutaciones en C1QTNF5, que codifica una proteína de función desconocida. La proteína C1QTNF5 fue secretada igualmente en direcciones apicales y basolaterales por las células del EPR. CFH y HTRA1/ARMS2 son los loci de riesgo mejor establecidos para AMD17,18,19. Las proteínas CFH y HTRA1 fueron secretadas por el EPR, de manera similar en direcciones apicales y basolaterales. El CFI, que también tiene alelos de riesgo de DMAE, se secretó más basolateral que apical (p < 0,01)18. Se ha demostrado que la CFH inhibe la neovascularización y la pérdida de función de la CFH se asocia con una mayor activación del complemento, inflamación y mayor riesgo de DMAE18,19,20. HTRA1 es una serina proteasa y se sabe que degrada EFEMP1 y THBS1, ambos secretados por las células del EPR21.

También se secretaron direccionalmente otras proteínas importantes para la regulación de la angiogénesis (Tabla 3). VEGF mostró una tendencia no significativa hacia la secreción basolateral direccional. PEDF, que inhibe la angiogénesis e induce la apoptosis de las células endoteliales, se secretó 2,9 veces más apical que basolateral (p <0,01). CRYAB, que inhibe la caspasa 3 y es neuroprotector para los fotorreceptores y también promueve la señalización y la angiogénesis de VEGF, fue secretado direccionalmente por el EPR 10,2 veces más apical que basolateral (p <0,0001)2. La PTN, que desempeña un papel complejo en la angiogénesis en múltiples enfermedades, incluido el cáncer, probablemente desempeña un papel proangiogénico en la retinopatía diabética22,23. PTN se secretó de manera similar en direcciones apicales y basolaterales.

Para investigar los efectos del estrés oxidativo sobre la secreción direccional de proteínas, las células se expusieron a H2O2 o tBH. El H2O2 se ha utilizado ampliamente para modelar el estrés oxidativo en la DMAE y anteriormente se demostró que aumenta la secreción de VEGF en el EPR24,25. Se utilizó tBH como segundo agente oxidante según informes anteriores de producción superior de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células ARPE19 con tBH en comparación con H2O226. Las células iPSC-RPE se trataron con H2O2 800 µM durante 24 h, o tBH 1 mM durante 6 h, con o sin pretratamiento con quercetina, un agente eliminador de ROS que se ha utilizado previamente para proteger las células RPE del estrés oxidativo27. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se midió utilizando carboxi-H2DCFDA, un reactivo permeable a las células que emite fluorescencia después de la reacción con ROS intracelulares (Fig. 3). iPSC-RPE ROS aumentó significativamente después de la exposición a H2O2 o tBH, y el efecto fue rescatado por la eliminación de ROS por quercetina en cada caso. Se eligió la incubación más larga de 24 h para H2O2, porque no se detectaron ROS después de una incubación de 6 h (datos no mostrados). El TEER de iPSC-RPE se recuperó hasta el valor inicial dentro de las 48 h posteriores a cualquiera de los tratamientos, lo que indica la salud general y la viabilidad de las células.

Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) después del estrés oxidativo en iPSC-RPE. El gráfico muestra la detección de fluorescencia relativa después de que iPSC-RPE se exponga a H2O2 800 µM o tBH 1 mM, con o sin pretratamiento con quercetina 400 µM, utilizando Carboxy-H2DCFDA como indicador fluorescente de ROS permeable a las células. Para los experimentos de H2O2, n = 12 para el grupo H2O2 y n = 6 para el grupo control y el grupo H2O2 + quercetina. Para los experimentos de tBH, n = 5 para todos los grupos. Todas las réplicas fueron biológicas; no hubo réplicas técnicas. Los resultados fueron analizados por Kruskal-Wallis para los experimentos con H2O2 debido al tamaño de muestra desigual, y mediante ANOVA unidireccional para los experimentos con tBH. *p < 0,05, ****p < 0,0001, ns = no significativo.

Las células iPSC-RPE en 9 pocillos replicados se trataron con H2O2 o tBH y el medio acondicionado se recogió 48 h después y se analizó mediante ELISA para VEGF, PEDF, CFH y PTN (Fig. 4). La comparación de los niveles previos al tratamiento de proteína apical y basolateral confirma los resultados de la espectrometría de masas. Las tendencias no significativas de mayor secreción basolateral de VEGF y mayor secreción apical de CFH y PTN observadas en espectrometría de masas se confirmaron y fueron significativas utilizando 9 pocillos replicados en ELISA (p < 0,0001 para VEGF y CFH, y p < 0,01 para PTN). . PEDF se secretó significativamente más apicalmente, similar a los resultados de la espectrometría de masas (p <0,0001).

El estrés oxidativo inducido por H2O2 altera la secreción polarizada del EPR de factores reguladores angiogénicos. Los gráficos de barras muestran diferencias en la secreción apical y basolateral de VEGF, PEDF, CFH y PTN antes (Pretratamiento, negro) y después de la incubación con (A) 800 µM H2O2 durante 24 h (Post-H2O2, gris claro), o ( B) 1 mM tBH durante 6 h (Post-tBH, gris claro). Las barras de color gris oscuro muestran los efectos protectores del pretratamiento con quercetina antes del estrés oxidativo con H2O2 o tBH. N = 9. Los resultados se analizaron mediante ANOVA de 2 vías pareada. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = no significativo. No hubo interacción significativa entre la polaridad y los efectos del tratamiento para PTN, pero aún se muestran los valores de p para las comparaciones post hoc.

El tratamiento con H2O2 y tBH alteró significativamente la secreción de las 4 proteínas y, en todos los casos, la secreción alterada se rescató al menos en parte con un pretratamiento con quercetina (Fig. 4). Para las 4 proteínas, los efectos fueron mayores con tBH que con H2O2. Los efectos de cada uno se pueden ver en la Fig. 4, y aquí se describen los efectos de tBH. El tratamiento con tBH aumentó la secreción de VEGF en el EPR en direcciones apical y basolateral (2,4 veces y 3,4 veces, respectivamente). El tratamiento previo con quercetina rescató este efecto y redujo la secreción de VEGF por debajo del valor inicial. El ANOVA de dos vías con diseño pareado mostró efectos principales significativos tanto de la polaridad (F(1,8) = 3409, p < 0,0001) como del tratamiento (F(2,16) = 19,908, p < 0,0001), así como una significativa interacción, lo que sugiere que el estrés oxidativo afectó la secreción basolateral más que la secreción apical (F (2,16) = 5934, p <0,0001). Por el contrario, el tratamiento con tBH disminuyó drásticamente la secreción de PEDF en el EPR tanto en dirección apical como basolateral (24,0 veces y 6,9 veces, respectivamente). El tratamiento previo con Quercetina rescató parcialmente esta disminución. El ANOVA de dos factores volvió a mostrar efectos principales significativos tanto de la polaridad (F(1,8) = 411, p < 0,0001) como del tratamiento (F(2,16) = 435, p < 0,0001), así como una interacción significativa ( F(2,16) = 243, p < 0,0001), lo que demuestra que el estrés oxidativo afectó la secreción apical más que la basolateral de PEDF.

El estrés oxidativo con tBH también disminuyó la secreción de CFH tanto apical como basolateralmente (23,4 y 22,4 veces, respectivamente). Si bien la quercetina rescató significativamente este efecto, el rescate fue menor para CFH que para las otras proteínas probadas. Hubo un efecto significativo de la polaridad (F(1,8) = 135, p < 0,0001) y el tratamiento (F(2,16) = 1820, p < 0,0001), así como una interacción significativa (F(2,16) ) = 95, p < 0,0001). Los efectos de la tBH fueron menores para la secreción de PTN, pero la tBH aumentó significativamente la secreción tanto apical como basolateral (1,5 veces y 1,6 veces, respectivamente), que fue rescatada por la quercetina. Aunque hubo un efecto principal significativo de la polaridad (F(1,8) = 8, p < 0,05) y el tratamiento (F(2,16) = 210, p < 0,0001), no hubo interacción significativa entre la polaridad y el tratamiento. lo que sugiere que el estrés oxidativo afecta de manera similar la secreción apical y basolateral de PTN. CRYAB, analizado mediante transferencia Western, fue indetectable al inicio del estudio y demostró un aumento de la secreción apical, pero no basolateral, después del estrés oxidativo con H2O2 (Fig. 5). Por el contrario, tBH aumentó la secreción tanto apical como basolateral de CRYAB. En todos los casos, la eliminación de ROS con quercetina evitó el aumento de la secreción de CRYAB.

El estrés oxidativo inducido por H2O2 y tBH aumenta la secreción de CRYAB polarizada por el RPE. La transferencia Western muestra CRYAB en medios condicionados apicales y basolaterales antes (PRE) y después (POST) de la incubación con (A) H2O2 800 µM durante 24 h, o (B) tBH 1 mM durante 6 h, con o sin pretratamiento con quercetina. . Como no existe una proteína endógena adecuada para la normalización entre las muestras apicales y basolaterales, se agregaron cantidades iguales de recovery (RCVRN) a las muestras y se usaron como controles. N = 3. Se muestran transferencias recortadas. Las imágenes sin recortar se encuentran en la figura complementaria 4.

En este estudio, se utilizaron células iPSC-RPE humanas para demostrar la secreción direccional de numerosas proteínas efectoras con funciones establecidas en la enfermedad de la retina. Un modelo de estrés oxidativo de DMAE alteró significativamente la secreción direccional de proteínas asociadas con la DMAE y la angiogénesis a favor de un microambiente proangiogénico. Para VEGF, PEDF y CFH, la prueba ANOVA de 2 vías demostró una interacción significativa entre la polaridad y el H2O2, lo que sugiere que el estrés oxidativo afecta la secreción apical y basolateral de manera diferente. Para CRYAB, la cuantificación previa al tratamiento mediante ELISA no fue posible ya que la proteína no era detectable; sin embargo, la transferencia Western demostró que el estrés oxidativo aumentó en gran medida la secreción apical y no la secreción basolateral usando H2O2, y tanto la secreción apical como basolateral usando tBH. Es probable que esto se deba a la mayor eficacia de la producción de ROS utilizando tBH, como se muestra en la Fig. 3. La secreción alterada de proteínas se rescató, al menos en parte, mediante la eliminación de ROS utilizando quercetina. La secreción de proteínas direccional alterada de las células del EPR puede desempeñar un papel importante en la fisiopatología de la DMAE.

Se eligió iPSC-RPE humano para modelar más estrechamente la enfermedad humana y evitar las deficiencias de la línea celular ARPE19 comúnmente utilizada, incluidas anomalías en la polaridad y la secreción polarizada28,29. El creciente campo del modelado de enfermedades del EPR utiliza cada vez más células iPSC-RPE, que pueden generarse fácilmente en el laboratorio, están terminalmente diferenciadas y no inmortalizadas, y no requieren donaciones recurrentes de tejido para el cultivo primario. La línea iPSC-RPE utilizada en este estudio demostró características distintivas de un RPE auténtico, incluida la pigmentación, la morfología, las propiedades de barrera y la expresión del marcador del RPE correctas. Otro punto fuerte de nuestro estudio fue el uso de soportes permeables para analizar por separado la secreción apical y basolateral. Estudios anteriores que utilizaron células del EPR cultivadas en plástico expusieron solo la superficie apical al medio y, por lo tanto, no lograron capturar los cambios en la secreción de proteínas basolateral. Varios factores de crecimiento y citocinas en nuestro estudio se secretaron principalmente basolateralmente, un hallazgo que se pasaría por alto sin el uso de soportes permeables. La neovascularización coroidea y la atrofia coroidea desempeñan un papel destacado en la patología de la DMAE. Por lo tanto, los cambios en el factor de crecimiento basolateral y la secreción de citocinas pueden ser clave en la patogénesis. Nuestro estudio tiene un uso limitado del estrés oxidativo, que es sólo un modelo propuesto de DMAE entre muchos. El estrés oxidativo del EPR es un componente bien establecido de la DMAE, pero existen muchos otros factores que contribuyen.

En nuestro modelo, el estrés oxidativo aumentó la secreción de factores proangiogénicos (VEGF, PTN y CRYAB) y disminuyó la secreción de factores antiangiogénicos (PEDF, CFH), contribuyendo en general a un entorno más angiogénico. La CFH también tiene un papel bien establecido en la regulación negativa de la activación del complemento y la inflamación, con importancia tanto para la DMAE exudativa como para la no exudativa18,19,20. Para VEGF, el aumento del efecto de secreción fue más basolateral que apical, lo que puede ser particularmente relevante para la neovascularización coroidea. Nuestros datos coinciden con estudios previos que demuestran un aumento de VEGF en respuesta al estrés oxidativo30,31. Anteriormente se demostró que el tratamiento con H2O2 de células ARPE-19 reduce la expresión de CFH, aunque no se investigó la secreción de proteínas20. Estudios previos de CRYAB han demostrado un efecto neuroprotector así como un aumento de la expresión de ARN en respuesta al estrés oxidativo32. El espectacular aumento de la secreción apical de CRYAB después del estrés oxidativo en nuestras células del EPR puede ser un mecanismo compensatorio para la protección de la retina neurosensorial. Sin embargo, también se ha demostrado que CRYAB desempeña un papel importante en la neovascularización, ya que los ratones knockout para alfa cristalina b son resistentes a la neovascularización retiniana en modelos isquémicos e inducidos por láser33. Por lo tanto, la secreción elevada de CRYAB puede contribuir a la DMAE exudativa, especialmente después del daño del EPR y la ruptura de la barrera del EPR.

Otros estudios han estudiado diferentes aspectos del secretoma polarizado del EPR. Algunos estudios han utilizado espectrometría de masas para caracterizar el secretoma apical únicamente de cultivos de EPR en placas de cultivo tradicionales y han encontrado alteraciones significativas en las proteínas secretadas involucradas en la angiogénesis y la regulación del complemento en respuesta al estrés oxidativo7,9. Otro estudio investigó un subconjunto del secretoma polarizado del RPE, investigando específicamente las proteínas contenidas en los exosomas del RPE34 porcino. Los exosomas son vesículas de tamaño entre 30 y 150 nm que transportan una carga variada que incluye proteínas, lípidos, ARN, ADN y metabolitos. También se informó que cuatro de las proteínas efectoras del RPE secretadas diferencialmente encontradas en nuestro estudio (cadena b de alfa-cristalina (CRYAB), anexina A1 (ANXA1), anexina A2 (ANXA2) y CD81) estaban enriquecidas en exosomas apicales, de acuerdo con la Los resultados de nuestro estudio muestran la secreción apical direccional de estas proteínas. Otros estudios han investigado el impacto de diferentes intervenciones, como la suplementación con zinc o la inactivación de la proteasa HtrA1, en el secretoma apical y basolateral del EPR10,11. Estos estudios previos encontraron más proteínas secretadas apicalmente que basolateralmente, similar a nuestro estudio, aunque no compararon específicamente la secreción apical con la basolateral para ninguna proteína individual11,34. Al igual que en nuestro estudio, estos estudios anteriores también utilizaron soportes permeables para separar las cámaras apical y basolateral. Utilizamos membranas de poliéster (PET) Transwell, que tienen un espesor de 10 µM con poros de 0,4 µM a una densidad de 4 × 106 poros/cm2. Estimamos que habría aproximadamente de 3 a 7 poros por celda del EPR. In vivo, las células del EPR están separadas de la vasculatura coroidea por la membrana de Bruch, que tiene entre 2 y 5 micrones de espesor según la edad35. No podemos excluir la posibilidad de que el soporte permeable impida la secreción de proteínas en los medios basolaterales y reduzca artificialmente las proteínas en los medios condicionados basolaterales y, por lo tanto, es posible que no modele completamente la secreción basolateral in vivo a la coroides.

En conclusión, las células del EPR están altamente polarizadas y la secreción direccional de proteínas efectoras es importante para la homeostasis de la retina neurosensorial y la coroides adyacentes. El estrés oxidativo cambió el equilibrio de los factores secretados por el EPR para favorecer una mayor angiogénesis y una mayor activación del complemento, y afectó de manera diferencial la secreción apical y basolateral, lo que puede tener implicaciones importantes para la neovascularización coroidea. Estos resultados respaldan estudios futuros que investiguen el papel de las proteínas efectoras del EPR secretadas diferencialmente en la salud de los fotorreceptores y la coroides para identificar objetivos terapéuticos en la DMAE y otras enfermedades degenerativas de la retina.

Las iPSC derivadas de fibroblastos de piel de donantes sanos se obtuvieron de LAgen Labs (Línea 006-BIOTR-0001 Clon 1). Esta línea celular se ha utilizado previamente para la diferenciación de iPSC-RPE y se validó en el Biotrust del Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic mediante la expresión de marcadores de células madre, cariotipo normal y diferenciación en las 3 capas germinales36. Nuestro estudio fue aprobado por el Comité de Supervisión de la Investigación de Células Madre Pluripotentes Humanas (HPSCRO) de la Universidad de Michigan y los experimentos se realizaron de acuerdo con sus pautas. El control de calidad en LAgen Labs incluyó iPSC con tinción positiva para los marcadores de pluripotencia Oct4, SSEA, Nanog y TRA-1-60, y un cariotipo normal. Las iPSC se cultivaron en placas de 6 pocillos en medio mTESR1 y se pasaron cuando alcanzaron una confluencia del 50 al 75%. Las iPSC se diferenciaron en RPE como se describió anteriormente37. Entre el día 50 y el día 90, se diseccionaron colonias de EPR, reconocidas por su pigmentación y morfología de adoquines, de las células circundantes utilizando una aguja de calibre 21 y se transfirieron a una placa de 24 pocillos recubierta con laminina a una densidad de 50.000 células/pocillo. Después de que iPSC-RPE se volvió confluente y recuperó la pigmentación y morfología apropiadas, las células se pasaron a Transwells recubiertos con laminina. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se disociaron con tripsina en células individuales y se sembraron en placas a una densidad de 335.000 células por cm2. Se añadió suero bovino fetal (FBS) al medio al 10 % durante 1 semana, al 3 % por semana y al 2 % durante 1 semana. El TEER se midió una vez por semana a partir de las 4 semanas posteriores al pase, utilizando un dispositivo EVOM con un electrodo STX2 (World Precision Instruments). Para experimentos de estrés oxidativo, las células iPSC-RPE se incubaron con 800 µm de H2O2 durante 24 h o hidroperóxido de terc-butilo (tBH) 1 mM durante 6 h, luego se cambiaron a medio de mantenimiento y se recogieron medios condicionados 48 h después.

Se sembraron células RPE derivadas de iPSC en placas de 96 pocillos a 120.000/cm2 y se mantuvieron durante 4 a 5 semanas antes del ensayo. Para los grupos experimentales con tratamiento con quercetina, las células se trataron previamente con quercetina 400 µM (#10005169 Cayman) diluida en medio RDM a 37 °C durante 2 h, y luego se enjuagaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), antes de la detección de ROS. . Para la detección de ROS, las células se cargaron con Carboxy-H2DCFDA 10 µM (diacetato de 6-carboxi-2', 7'-diclorodihidrofluoresceína, n.º C400 Invitrogen) diluido en HBSS y se incubaron a 37 °C durante 45 minutos. Se eliminó el tinte y las células se lavaron una vez con HBSS. Luego se añadió tBH 1 mM (hidroperóxido de terc-butilo, #458139 Sigma) o H2O2 800 µM y se incubó durante 6 h y 24 h, respectivamente. El nivel de ROS intracelular se midió y cuantificó a Ex = 485 nm y Em = 520 nm utilizando un lector de placas (Omega, BMG LABTECH). Las células tratadas solo con Carboxy-H2DCFDA se usaron como control inicial, las células tratadas con tBH o H2O2 solo se usaron como control oxidante y las células no tratadas se usaron como control de fondo (restadas de todos los demás grupos).

Los medios iPSC se cambiaron a medios RDM-B18, en los que el suplemento de B27 se reemplaza con el suplemento de B18 (medio neurobasal con 0,0125 % de catalasa, 0,625 % de glutatión, 0,0313 % de insulina humana, 375 kU/L de superóxido dismutasa bovina, 0,025 % de holo- transferrina, T3 192 µM, l-carnitina 7,75 mM, etanolamina 12,5%, d+-galactosa 694 mM, putrescina 70,9 mM, selenito de sodio 7,23 µM, corticosterona 1,80 mM, ácido linoleico 446 µM, ácido linolénico 2,24 mM, progesterona 3,98 mM, 3,8 1 Acetato de retinol mM, dl-alfa tocoferol 14,5 mM, acetato de dl-alfa tocoferol 26,4 mM, ácido oleico 4,43 mM, ácido pipecólico 968 µM, biotina 512 µM). Los medios se recogieron después de 16 h, se agregaron inhibidores de proteasa y los medios se congelaron inmediatamente a -80 °C. Los medios se reemplazaron con medios de mantenimiento RDM y la recolección de medios B18 se repitió una vez por semana. Los medios congelados se agruparon en 3 triplicados biológicos de 3 conjuntos diferentes de pocillos para el primer conjunto de datos y 4 réplicas biológicas de 4 conjuntos diferentes de pocillos para el segundo conjunto de datos, con correspondencia de edades entre los grupos para el número de semanas posteriores al paso. Los medios se descongelaron y se concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml con un límite de peso molecular de 3 kDa, con intercambio de tampón por solución salina tamponada con fosfato (PBS). La concentración final de proteína se midió utilizando el ensayo de proteína RC DC (Bio Rad). Al planificar la proteómica comparativa entre estas 2 muestras, consideramos que el contenido y la cantidad de proteínas pueden ser dispares entre las muestras apicales y basolaterales y, por lo tanto, se agregó una proteína recombinante exógena en igual concentración en todas las muestras para usarla para la normalización. Se eligió Recoverin porque tiene varios péptidos únicos para la identificación en espectrometría de masas y no se expresa en células del EPR. Se añadió recoveryina recombinante a una concentración final de 0,2 µg/µl a cada muestra. Las abundancias finales de péptidos se normalizaron con respecto a la recovery y se corrigieron según los factores de concentración para comparar la cantidad total de cada proteína presente en las muestras apicales frente a las basolaterales.

Las muestras de proteínas se enviaron al Centro de Recursos de Proteómica de la Universidad de Michigan. El etiquetado de etiquetas de masa en tándem (TMT) y el análisis LC-MS/MS se realizaron como se describió anteriormente, utilizando TMT-6 plex o TMT-16 plex (ThermoFisher) y un espectrómetro de masas Orbitrap Tribid Fusion (Thermo Scientific)38. Los datos se analizaron utilizando Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher). Los valores de señal a ruido para cada ion indicador en los datos de MS/MS se extrajeron y sumaron para cada péptido y se normalizaron en función de la recuperación S/N. La intensidad total en todos los canales se escaló al 100%. Se buscaron espectros MS/MS en la base de datos de proteínas humanas UniProt15. El análisis de la ruta se realizó en iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, Ann Arbor, MI)12.

Se recolectaron células iPSC-RPE polarizadas en Transwells y se extrajo el ARN utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen). Se preparó ADN complementario con 250 ng de ARN total utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) y se realizó una PCR acoplada a RT multiplexada el mismo día por triplicado utilizando POWER SYBR™ Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) para los siguientes genes: BEST1, CRALBP1, LRAT, MERTK, PEDF y RPE65. Las reacciones de PCR se realizaron en el Biorad iCycler. Los niveles relativos de transcripción se normalizaron a ACTB.

Para preparar medios condicionados, se recogieron medios condicionados RDM de las cámaras apicales y basolaterales de iPSC-RPE polarizado, se añadió tampón dodecilsulfato de sodio (SDS), se añadió recovery recombinante para la normalización a una concentración final de 0,5 nM y se utilizó medio. inmediatamente para electroforesis en gel, inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o almacenar a -80 °C. Las proteínas se separaron mediante electroforesis con SDS-poliacrilamida (SDS/PAGE) y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con tris (TBS) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 2% y tween-20 al 0,5%, se incubaron con anticuerpo primario durante la noche, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h. Las transferencias se desarrollaron con EcoBright Femto HRP (Soluciones innovadoras). Las bandas se visualizaron y fotografiaron utilizando un Azure c500 (Azure Biosystems). La cuantificación de la densitometría se realizó mediante el software ImageJ. Los principales anticuerpos utilizados fueron: anti-CRYAB (Enzo, ADI-SPA-223), anti-RCVRN (Millipore, AB5585) y anti-RCVRN (Proteintech, 66521-Ig).

Los kits ELISA para VEGF (R&D Systems, SVE00), PEDF (R&D Systems, DY117705), CFH (R&D Systems, DY4779) y PTN (Invitrogen, EH370RB) se utilizaron según las instrucciones del fabricante. En el caso de los kits ELISA PEDF y CFH, los pocillos se recubrieron con anticuerpo de captura (diluido en PBS) durante la noche a temperatura ambiente. Luego se bloquearon los pocillos con diluyente de reactivo durante 1 hora a temperatura ambiente. En el caso de los kits VEGF y PTN ELISA, las placas venían prerrevestidas y prebloqueadas. El medio condicionado se diluyó con diluyente de ensayo, se añadió a la placa prerrecubierta por triplicado y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió a la placa anti-VEGF, anti-PEDF, anti-CFH o anti-PTN conjugados con HRP y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Después de revelar con H2O2 y el cromógeno tetrametilbencidina, se determinó la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de microplacas. Se utilizaron concentraciones estándar de VEGF, PEDF, CFH o PTN recombinantes en paralelo para generar una curva estándar para calcular las concentraciones.

Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, se lavaron y bloquearon durante 1 h en tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina (BSA) al 3%, glicina 0,3 M, Triton X-100 al 0,15%, albúmina de burro al 1%). suero). Las células se incubaron en anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, se lavaron y se incubaron en anticuerpo secundario con DAPI (ThermoFisher) y conjugado de faloidina (Biotium, 00050-T). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-ZO-1 (Invitrogen, 33-9100), anti-CD147 (BDPharmigen, 563020), anti-ezrin (Invitrogen, MA5-13862) y anti-kir7.1 (Santa Cruz, sc- 22438). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: IgG anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, 715-545-150) e IgG anti-conejo de burro (Jackson Immunoresearch, 711-545-152).

Para los resultados de proteómica, los valores de P se calcularon utilizando el software Proteome Discoverer utilizando una prueba T de estudiante para comparar las medias apicales y basolaterales de cada proteína. Dada la gran cantidad de proteínas que se comparan, el ajuste para comparaciones múltiples empleó el enfoque de tasa de descubrimiento falso de Benjamin y Hochberg. Se consideró significativo al menos un cambio de 2,0 veces y un valor de p ajustado de <0,05. Para el análisis de las funciones moleculares de las proteínas secretadas diferencialmente en la Fig. 2B, el análisis se realizó mediante Advaita iPathwayGuide como se describió anteriormente13. Brevemente, el programa calculó la probabilidad de observar una cantidad de proteínas secretadas diferencialmente anotadas para una función molecular dada que es igual o mayor que la cantidad real observada de proteínas secretadas diferencialmente para esa función molecular, y el valor p se corrigió para detectar errores. tasa de descubrimiento. Para los estudios de detección de ROS, se usó un ANOVA unidireccional no apareado con una corrección de Tukey para comparaciones múltiples para los experimentos de tBH, y se usó una prueba de Kruskal-Wallis con una corrección de Dunn para los experimentos de H2O2 debido a un número de tamaño de muestra desigual que resultó en resultados desiguales. diferencia. Para los resultados de ELISA antes y después del estrés oxidativo, se utilizó un ANOVA de 2 vías emparejado con una corrección de Tukey para comparaciones múltiples. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

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El Dr. Fahim recibió el apoyo de un premio K12 (K12EY022299) y un premio K08 (1K08EY032991) del Instituto Nacional del Ojo, un premio de la Choroideremia Research Foundation, un premio Eversight Vision y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness. Este trabajo utilizó el Vision Research Core financiado por P30 EY007003 del National Eye Institute. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a Patrice Fort, PhD, por el anticuerpo CRYAB.

Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48105, EE. UU.

Lisheng Chen, N. Dayanthi Perera, Athanasios J. Karoukis, Kecia L. Feathers, Robin R. Ali, Debra A. Thompson y Abigail T. Fahim

Centro KCL de Terapia Celular y Génica, Londres, WC2R 2LS, Inglaterra, Reino Unido

Robin Ali

Departamento de Química Biológica, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48105, EE. UU.

Debra Thompson

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LC contribuyó al diseño experimental, realizó experimentos, ayudó a preparar la Fig. 1 y revisó el manuscrito. NDP mantuvo cultivos celulares, realizó experimentos y ayudó a preparar las Figs. 1 y 5. AJK mantuvo cultivos celulares y realizó experimentos. KLF realizó experimentos y revisó el manuscrito. RRA contribuyó al diseño experimental y revisó el manuscrito. DAT contribuyó al diseño experimental y revisó el manuscrito. ATF conceptualizó el estudio, contribuyó al diseño experimental, analizó los datos, escribió el manuscrito y preparó las figuras. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Abigail T. Fahim.

ATF tiene acciones en Ionis Pharmaceuticals y es consultor de Janssen Pharmaceuticals. KLF y DAT cuentan con el apoyo de investigación de MeiraGTx. DAT ha presentado una patente sobre terapia génica. NDP, AJK, LC y RRA no tienen intereses en competencia que revelar.

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Reimpresiones y permisos

Chen, L., Perera, ND, Karoukis, AJ et al. El estrés oxidativo afecta de manera diferencial la secreción apical y basolateral de factores angiogénicos de las células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de iPSC humanas. Informe científico 12, 12694 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16701-6

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Recibido: 20 de diciembre de 2021

Aceptado: 14 de julio de 2022

Publicado: 26 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16701-6

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